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【知识分享】5种荧光PCR试剂染料工作原理!

2022-05-07 15:50:28

作者:风尘男土

文章来源:体外诊断IVD知识库


用于荧光定量PCR仪的化学染料有多种,包括SYBR Green I、分子 Beacons、水解探针(TaqMan 探针)、ScorpionsTM 探针和AmplifluorTM系统。它们也可完成实时量化和DNA解链曲线。下面将为大家一一介绍: 


1. SYBR Green I 

SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后,其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm,发射波长最大约为520nm。 

SYBR Green I在核酸的实时检测方面有很多优点,由于它与所有的双链DNA相结合,不必因为模板不同而特别定制,因此设计的程序通用性好,且价格相对较低。此外,由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合,因此SYBR Green I的灵敏度很高。但是,由于SYBR Green I与所有的双链DNA相结合,因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精 确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响1。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green I得到定量结果。


2. 分子 Beacons 

分子 Beacons是一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中,位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。在此结构中,荧光基团被激发后不是产生光子,而是将能量传递给淬灭剂,这一过程称为荧光谐振能量传递(FRET)。由于”黑色” 淬灭剂,由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。如果第二个荧光基团是淬灭剂,其释放能量的波长与荧光基团的性质有关。( 生物 秀实验频道 www.bbioo.com ) 

分子Beacons的茎环结构中,环一般为15-30个核苷酸长,并与目标序列互补;茎一般5-7个核苷酸长,并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端,而淬灭剂由连接于另一端。分子Beacons必须非常仔细的设计,以致于在复性温度下,模板不存在时形成茎环结构,模板存在时则与模板配对。与模板配对后,分子Beacons的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时,它发出自身波长的光子。 

分子Beacons不同于SYBR Green的一个优点就是它特异性地检测感兴趣的目标DNA。通过精心设计分子Beacons和优化反应条件(温度和缓冲液)后,其灵敏度非常高,可用于单核苷酸多态性(SNPs)的检测。但是,为检测某一特定的目标DNA,每一个探针都必须单独地仔细地设计。 分子Beacons是美国纽约公共健康研究学会的技术专利。 


3. 水解探针(TaqMan 探针) 

TaqMan探针是多人拥有的专利技术。TaqMan探针是一种寡核苷酸探针,它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的5’末端,而淬灭剂则在3’末端。 

当完整的探针与目标序列配对时,荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时,聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切,使得荧光基团与淬灭剂分离。TaqMan探针适合于各种耐热的聚合酶,如DyNAzymeTM II DNA聚合酶(MJ Research公司有售)。随着扩增循环数的增加,释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。


4. ScorpionsTM 探针 

ScorpionsTM 探针包括一个扩增引物和一个目标特异性探针,探针部分通过碱基互补形成茎环结构,使得荧光基团与淬灭剂靠近。( 生物 秀实验频道 www.bbioo.com ) 

在扩增过程中,目标序列的延伸通过ScorpionsTM 探针的引物部分来完成。在变性后降温过程中,通过单分子重组,ScorpionsTM 探针的探针部分与扩增产物结合,互补的茎环结构被破坏,使得荧光基团与 淬灭剂 分离。由于ScorpionsTM 探针是扩增产物的一部分。因此荧光强度与扩增的目标序列数量直接相关。 


5. AmplifluorTM 通用检测系统 

Amplifluor系统使用一个通用的引物,只有在引物进入到扩增产物中之后才能发出荧光信号。此引物包含一个18碱基的序列(”Z 序列”),”Z 序列”互补形成发夹结构,在发夹结构上标有荧光基团与 淬灭剂 。首先,目标序列通过特异性引物进行扩增,其中一个引物的5’端加上了Z序列。在随后的扩增循环中,通用引物与Z序列配对并进行扩增,从而进行扩增产物中。在此过程中,发夹结构的打开,使得荧光基团与淬灭剂分离,因此发射的荧光信号的强度与扩增产物的数量成正比。




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