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技术 | 主流等温扩增技术原料简介

2022-11-22 15:42:33

文章来源:严选IVD原料


近年来,随着分子生物学技术的迅速发展,基于核酸检测的诊断方法已大量建立并广泛应用于人类疾病的实验室检测中。


与其他的核酸扩增技术相比,等温扩增有快速、高效、特异的优点且无需专用的设备,所以它一经出现就被许多学者认为是一种有可能与PCR媲美的检测方法。


相信以等温核酸扩增技术为基础的诊断仪器和试剂盒的开发和应用会是未来一、二十年的方向。本文介绍目前常见的主流等温核酸扩增技术: LAMP、RPA、RCA、CPA、SDA和HDA,帮助大家了解其原理。


主流等温扩增技术原理介绍

1、LAMP环介导等温扩增技术


原理:针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下,基因模板、引物、链置换型DNA合成酶等在60--65℃进行恒温扩增,15-60分钟左右即可实现109~1010倍的核酸扩增。


环介导等温扩增法,是一种新型的核酸扩增方法,具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。在DNA合成时,从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应,产生大量焦磷酸镁沉淀,呈现白色。因此,可以把浑浊度作为反应的指标,只用肉眼观察白色浑浊沉淀,就能鉴定扩增与否,而不需要繁琐的电泳和紫外观察。由于环介导等温扩增反应不需要PCR仪和昂贵的试剂,有着广泛的应用前景。


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2、RPA重组酶聚合酶扩增技术



原理:重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物,能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列,就会发生链交换反应形成并启动DNA合成,对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合,防止进一步替换。在这个体系中,由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快,一般可在10分钟之内获得可检出水平的扩增产物。


RPA技术主要依赖于三种酶:能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性,最佳反应温度在37°C左右。

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3、RCA滚环扩增技术


原理:以环状 DNA 为模板,通过一个短的 DNA 引物(与部分环状模板互补),在 phi29 DNA 聚合酶催化下将 dNTPs 转变成单链 DNA,此单链 DNA 包含成百上千个重复的模板互补片段。这种方法不仅可以直接扩增 DNA 和 RNA,还可以实现对靶核酸的信号放大,灵敏度达到一个拷贝的核酸分子,因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。


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4、CPA交叉引物扩增技术


原理:CPA是2008年由优思达公司独立研发成功的一种新的核酸恒温扩增技术,也是中国首 个具有自主知识产权的核酸扩增技术。它针对目的基因4或5个区域设计4或者5条特异性引物,利用具有链置换特性的Bst DNA聚合酶、甜菜碱,在63 ℃左右条件下进行高效、快速、高特异地扩增靶序列。


根据交叉引物数量的不同,CPA可分为双交叉扩增(共4条引物=2条交叉引物+2条剥离引物)和单交叉扩增(共5条引物=1条交叉引物+2条剥离引物+2条普通引物)。CPA在63 ℃左右进行,依赖Bst DNA聚合酶、甜菜碱和交叉引物。


双交叉引物扩增使用两条交叉引物和两条剥离引物。两条交叉引物分别与模板链互补结合后延伸,随后剥离引物在Bst DNA聚合酶的作用下将新合成的单链剥离,最后两条交叉引物在Bst DNA聚合酶的作用下以新生单链为模板合成大量目的片段。


单交叉引物扩增使用一条交叉引物、两条剥离引物和两条普通引物。首先交叉引物与模板链结合并延伸为双链,而剥离引物在Bst DNA聚合酶的作用下将新链与模板分离;随后普通引物以新链为模板,合成两条不同长度的单链DNA;最后以这两条单链为模板,以交叉引物与普通引物为引物对,形成扩增循环。



5、SDA链置换扩增技术


原理:这是一种基于酶促反应的 DNA 体外等温扩增技术,主要利用限制性内切酶剪切 DNA 识别位点的能力和 DNA 聚合酶在切口处向 3 延伸并置换下游序列的能力,在等温条件下进行扩增。整个过程由准备单链 DNA 模板、生成两端带酶切位点的目的 DNA 片段、SDA 循环扩增 3 个步骤组成。


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6、HDA解旋酶依赖性扩增技术


原理:依赖解旋酶 DNA 等温扩增技术 (HDA) 是美国NEB 公司于 2004 年发明的一种新型核酸等温扩增技术。该技术模拟体内 DNA 复制的自然过程,利用解旋酶在恒温下解开 DNA 双链,再由 DNA 单链结合蛋白稳定已解开的单链为引物提供模板,然后在 DNA 聚合酶的作用下合成互补的双链,继而不断重复上述循环扩增过程,最终实现靶序列的指数式增长。


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