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超详细!qPCR扩增曲线异常结果分析

2023-03-13 03:01:19

文章来源:百力格生物

作者:BiOligo


在qPCR的实验过程中,不论是“新手”还是“老手”或多或少都会遇到扩增曲线异常的情况,给结果判读带来很大的困扰。异常曲线的出现可能是单个的原因(这种情况通常对单一因素调整后就会变为正常),也有可能是多个原因综合影响导致而成的,这时就需要仔细分析,控制变量进行重复验证。


对于异常曲线的分析在总结完异常曲线的特征之后,需要按照“人、机、料、法、环”的思路进行逐一排查,虽然说异常曲线的结果可能是“千奇百怪”,但是任何的结果仔细寻源后都可以找到其产生的原因,所以理清思路、具体原因具体分析是对异常结果判读与解决的关键。


以下是小编为大家整理的探针法qPCR常见问题,根据常见的问题结合应用实例供大家参考。


仪器、耗材与配件问题

使用普通PCR仪器所用耗材

普通耗材一般透光度比较差,会造成荧光扩增曲线异常,比如打折的扩增曲线。

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使用质量较差的耗材

质量较差耗材可能会引起荧光值不稳定,这会造成反应孔的自动基线扣除错误,得到不准确的Ct值(上图),更换质量好的耗材后,荧光信号正常(下图)。


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封膜质量不好

如果96孔板封膜质量不好,在PCR过程中则会受到水蒸气的影响,容易产生变形,会引起 “光学扭曲”现象(上图),使用ROX作为参比染料,校正荧光信号变化后均一化的扩增曲线正常(下图)。


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仪器不稳定-扩增曲线有向上或者向下的尖峰

可能是电压不稳或者是光源不稳导致荧光波动,如下图所示。


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自动基线设置

自动基线设置过高可能会出现扩增下降,如下图所示。可以进行手动设置基线,将baseline end设置为“扩增信号出现的前一个循环”。

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反应体系-加样问题

反应体系存在蒸发,水分丢失

ROX 浓度会增加,ROX参比荧光上抬(上图),而正常孔中ROX荧光会一直不变(下图)。


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反应体系存在严重蒸发—山域型曲线

轻微的蒸发会是一种缓慢的上升,严重的蒸发会呈现先上升后下降的曲线,这两类异常曲线可以通过观察检测后的反应管液面是否下降来区分。


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反应体系存在气泡

上机的反应体系里有大的气泡,中间容易形成折射,干扰荧光的采集,如下图所示。

此外如果反应体系存在气泡也有可能出现扩增曲线有向上或者向下的尖峰,和仪器问题的最大区别是存在气泡是单一样本偶发的,而仪器问题会出现一致的波动。

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反应体系-体系问题


引探配比不当

下图1引探量过少,导致平台期提前,荧光增量低;2、3为适宜引探量范围,4引探量过高,导致扩增不彻底、无平台期。

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酶量使用不当

不同扩增重复数、不同模板质量或者扩增难度,对酶量的要求不一样,酶量少会使扩增不彻底,终点荧光值低;酶量过多则会导致平台期上扬。


酶量不足扩增曲线

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酶量过多扩增曲线


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dNTP量使用不当

dNTP量过少或过多均会影响扩增效果。1~5号是dNTP量逐渐增多测试的扩增曲线图,1~3号Ct值保持不变、荧光增量逐渐增大,3~5号Ct值逐渐变大、4号和5号扩增曲线线形变差,最适dNTP量为3号。


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存在扩增抑制剂

可能是样本本身存在过多抑制剂:结构蛋白、脂肪、多糖等,也有可能是模板提取试剂残留:乙醇、蛋白酶K、苯酚等,如下图H07扩增曲线存在扩增抑制,这种情况可以重新提取样本或者将样本稀释后再扩增。

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扩增曲线末尾起跳

末尾起跳可能有较多因素,包括:1)存在污染;2)非特异性扩增;3)样本浓度低;4)酶特异性差,可以进行逐一排查。


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无扩增曲线或无Ct值

作为最常见的情况,如下图所示,可能原因包括:1)PCR 参数设置错误:在设计循环参数时没有设置荧光信号采集;2)模板降解 : 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融;2)引物或者探针降解:可通过 PAGE 电泳检测其完整性;4)电脑设置了自动休眠。


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异常的曲线“千千万万”,但是追根溯源还是围绕着“人、机、料、法、环”,按照可能原因进行一一核查,控制变量,重复验证,获得完美曲线并不难哦~



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