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学术天地|定向进化之常用的文库构建方法介绍

2023-04-14 03:36:50

前言


1993年,诺贝尔化学奖获得者之一的科学家Frances H. Arnold首先提出酶分子的定向进化这一概念,同时提出用于天然酶的改造或构建新的天然酶的基本方法-易错PCR。


酶的定向进化总体上可分为三个步骤,即构建突变文库、体外重组、高效筛选,循环往复,直到获得符合预期的酶,如图1所示。通过定向进化,酶的性能得以提升或获得新的性能特征,满足更多研究及应用需求。

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图1 酶的定向进化流程



常用的文库构建方法有易错PCR、全质粒大引物PCR、饱和突变、DNA改组、体外随机重组、交错延伸等方法。



01


易错PCR




易错PCR(Error-Prone PCR),是最常用的创建随机突变文库的方法。这种方法利用Taq酶低保真度的特点,辅以高浓度的Mg2+和Mn2+,提高扩增体系碱基发生错配的概率,理论上能覆盖所有的突变体。但突变文库中会存在假阳性,受模板质粒影响较大,有效去除模板质粒是此方法的关键。



02


全质粒大引物PCR




全质粒大引物PCR(Megaprimer PCR of Whole Plasmid, MEGAWHOP),这种方法克服了易错PCR产物酶切、连接的缺陷,即模板质粒的影响。全质粒大引物PCR法主要分为四个步骤,即制备DNA大引物、PCR扩增全质粒、DpnI处理PCR产物和转化。


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图2  MEGAWHOP-PCR构建突变文库流程图


03


饱和突变




饱和突变(Saturation Mutagenesis)是指靶位点氨基酸置换成其他19种氨基酸的突变方法。根据基本原理可分为寡核苷酸定向突变、盒式诱变、重叠延伸PCR等方法,不同方法有各自的优缺点,可根据实际情况进行选择。


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表1 不同饱和突变方法优缺点



04


DNA改组





DNA改组(DNA Shuffling)是利用DNaseI对突变的目的基因进行酶切,使目的基因形成许多不同大小的随机片段,再利用这些片段进行无模板扩增,随机片段互为引物和模板,在扩增过程中重组,得到突变体。


目的基因可通过易错PCR获得,但改组时无引物PCR组装可能全部来自同一个亲本,突变效率降低。因此,利用基于ssDNA的DNA家族改组(DNA Family Shuffling)能够降低来自亲本的影响。将亲本目的基因进行5’磷酸化,再利用λ核酸外切酶降解双链DNA,得到ssDNA,将ssDNA等摩尔比混合后再利用DNaseI进行酶切和PCR扩增。


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图3 DNA Shuffling原理示意图



05


体外随机重组





体外随机重组(Random-Priming in Vitro Recombination, RPR )是以单链DNA为模板,辅以兼并引物,产生互补于模板不同位点的短DNA片段,短DNA 片段中会有少量的点突变,在随后的PCR反应中,它们互为引物进行重组成完整的基因长度。


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图4 体外随机重组原理示意图


06


交错延伸





交错延伸(Staggered Extension Process, StEP),实际上是两次PCR过程。第一次PCR中只设置退火和延伸,退火和延伸时间只设置5-15 s以获得短片段,第二次PCR设置标准PCR以扩增全长基因。


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图5 交错延伸示意图

以上是构建突变文库常用的一些方法介绍,除此外还有RACHII、ITCHY等方法,需配合高效的筛选方法才能达到高通量筛选的目的。


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