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学术天地|无细胞生物合成系统

2023-06-09 11:36:39

前言


无细胞生物合成系统是无需活细胞的合成生物学手段,能通过体外实现并控制基因转录和蛋白质翻译,从而人工设计出新的具有生物学功能的产品或体系。简单来说,无细胞生物合成系统能在体外实现生物学中心法则(图1),实现遗传信息从DNA传递给RNA,再从RNA传递给蛋白质,即完成遗传信息的转录和翻译的过程;遗传信息也可以从DNA传递给DNA,即完成DNA的复制过程。



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图1 生物学中心法则



一、无细胞生物合成系统的分类


无细胞生物合成系统具有简单性、开放性和易放大性等特点,因此能与其他学科和技术手段相融合,产生巨大价值。


无细胞生物合成系统根据产物类型及相关学科,在无细胞合成生物学方向可以分为无细胞蛋白合成系统和无细胞代谢工程(图2)。

无细胞代谢工程主要利用多酶系统进行生物制造。而无细胞蛋白合成(cell-free protein synthesis,CFPS)系统是一种快速而且能高通量表达目标蛋白的技术(图3),是以外源DNA或mRNA为模板,在细胞裂解液提供多种酶的作用下通过补充底物和能量物质来实现蛋白的体外合成[1-2],系统需要细胞裂解液、能量源、核苷酸、氨基酸、盐、辅助因子、线性或质粒DNA和缓冲液来维持反应,合成的蛋白可用于结构生物学研究、高通量筛选、重组药物等。目前CFPS系统主要有大肠杆菌裂解液、兔网织红细胞裂解液、小麦胚芽提取物、酵母提取物共4种体系。



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图2 无细胞合成生物学分类


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图3 CFPS系统在单管中进行的示意图[3]



二、无细胞生物合成的优缺点


和细胞内表达系统相比(图4),无细胞生物合成系统没有细胞膜的阻隔,在系统内可直接调控不同基因的转录、翻译、代谢等生物活动;不含基因组,无生长需求,无细胞毒害作用;作为一个开放体系,无传质限制,易添加底物和去除产物,可快速监测和分析。



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图4 细胞内表达系统与CFPS系统的比较[3]



但无细胞生物合成由于反应体系成分较多,成本较高,同时反应体积也较小。目前的CFPS表达体系的构建主要基于原核微生物大肠杆菌,但是由于密码子偏好和缺乏翻译后修饰机制等问题,其在表达高GC含量基因编码蛋白和需要翻译后修饰的真核蛋白等方面存在很多不足之处[4]。


三、无细胞生物合成的应用


细胞生物合成无细胞限制,因此尤其适用于有毒性目的产物的合成,而无细胞蛋白表达可以解决蛋白表达不出来、表达的蛋白没有活性、原核蛋白表达产物有包涵体的问题。

除此之外,无细胞蛋白表达能够应用于可溶蛋白和膜蛋白表达、蛋白质功能鉴定、高通量筛选、分子间互作分析。还适用于在大肠杆菌中,对于难以表达的蛋白质、蛋白质分子定向进化、噬菌体生产、蛋白-蛋白互作、蛋白-核酸互作、蛋白与小分子的相互作用、酶活检测等均有应用价值。


参考文献:

1. Ke Yue, Tran Nam Trung, Yiyong Zhu, Ralf Kaldenhoff, Lei Kai. Co-translational insertion of aquaporins into liposome for functional analysis via an E. coli based cell-free protein synthesis system. Cells, 2019, 8, 1325.
2. Max Z. Levine, Nicole E. Gregorio, Michael C. Jewett, Katharine R. Watts, Javin P. Oza. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for arobust, flexible, and accessible platform technology. Jove-Journal of Visualized Experiments, 2019, 144, e58882.
3. Khushal Khambhati, Gargi Bhattacharjee, Nisarg Gohil, Darren Braddick, Vishwesh Kulkarni, Vijai Singh. Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2019, 7, 248.
4. Lingkai Zhang, Wan-Qiu Liu, Jian Li. Establishing a eukaryotic Pichia pastoris cell-free protein synthesis system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2020, 8, 536.



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