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3分钟!了解限制性核酸内切酶在mRNA药物生产中的应用

2023-08-11 09:44:00

前言


限制性核酸内切酶是用来识别特定的脱氧核苷酸序列,并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。在分子生物学研究中,限制性核酸内切酶广泛应用于DNA基因组物理图谱的组建、基因的定位和基因分离、DNA分子碱基序列分析、相关DNA分子和遗传工程、基因工程编辑。

在过去的几年里,mRNA疫苗和基因治疗产业化得到了快速发展,新冠mRNA疫苗的上市极速推动了产业的发展。实际情况的紧迫需求以及 mRNA技术自身无限的临床应用前景都使得mRNA在生物行业举足轻重。mRNA疫苗属于第三代疫苗,本质为核酸疫苗。经优化设计的外源mRNA导入细胞后可利用胞内的蛋白组装系统进行翻译,从而产生相应的抗原,激活免疫系统。

mRNA规模化生产主要依靠体外转录,一段DNA模板在RNA 聚合酶的作用下利用NTP为底物进行酶促反应,1μg的DNA模板通常转录产量能达到100-200μg左右。在此过程中,DNA模板作为重要的信息载体承担重要的任务。尽管目前市面上推出类似“一锅法”mRNA制备工艺,但DNA作为mRNA生产过程中的中间品,对批间稳定性,工艺稳定性等方面的研究仍有不可替代的作用。


用作转录的DNA模板通常由两种方式制备,首先是PCR的方式,引物设计通常会选择在T7启动子上游和poly(A)模板下游,以得到一段带有T7启动子的模板序列。这种采用扩增的方式制备DNA模板在研究阶段尚可行,受限于PCR复杂的温度控制,PCR制备模板的方式在mRNA的工业生产中用途有限。


PCR扩增制备体外转录模版位点示意


限制性内切酶制备体外转录模版位点示意

得益于基因治疗的发展,质粒的工业化生产至今已有数十年的历史,发展相对成熟。研究者发现将质粒作为mRNA工业化生产的模板具有先天优势。借助于基因治疗中质粒的发展和纯化工艺,能迅速得到合格的用于mRNA生产的质粒。

基因治疗中使用的质粒通常具有闭合环状的超螺旋结构。在mRNA制备过程中,借助于质粒中的T7启动子,RNA聚合酶能高效地转录T7下游的序列。体内转录的终止发生时往往通过依赖ρ因子和不依赖ρ因子的方式进行,而体外转录受限于质粒的特殊结构,往往需要人为制造转录的终止位点。

出于稳定性和免疫原性考虑,mRNA的模板设计通常需要在3'添加长度为70-110的poly(A)序列,因此转录终止的位点往往限定在紧邻poly (A)序列的末尾,而限制性内切酶成为首选,此过程被称为质粒模板线性化。

使用限制性内切酶制备mRNA转录模板具有以下优势:

01

适合工艺放大

使用限制性内切酶进行模板的制备只需要在纯化质粒的基础上增加酶切的过程,随后利用上游质粒的纯化平台再次进行线性化模板的回收。根据实际需要,酶切体系较为容易放大,在mRNA的工业生产领域,往往借助生物反应器实现此过程。


02

不受序列影响

限制性内切酶种类极为丰富,用于质粒模板线性化的限制性内切酶有多种选择,因此,使用限制性内切酶进行线性化模板的制备时能够不受内部序列的影响,可以灵活选择不同限制性内切酶。


03

不会额外引入其他复杂杂质

酶切反应体系简单,成分清楚,反应完成后,只需要进行简单的层析即可有效除去反应产物中的蛋白分子以及各种小离子,经过初步纯化后的酶切产物,其纯度基本已达到下游转录实验的要求。


用于mRNA制备的限制性内切酶与普通限制性内切酶的差异

01

高效稳定

质粒模板的线性化在整个mRNA的生产过程中虽然是相对简单的一步,但线性化模板的质量直接决定了下游转录产物的质量,因此选择一款高效、稳定的限制性内切酶尤为重要,这也对限制性内切酶在批次、存储方面的稳定性有了更高的要求。

02

无动物源配方和生产过程

由于GMP级辅料具有严格的质量要求,因此,在内切酶生产中,从菌体培养发酵,到酶原液制备,均使用无动物源试剂和辅料,所配套使用的反应缓冲液在配制过程中也使用无动物源类试剂。

03

避免产生 3'突出末端

用于制备线性化模版的限制性内切酶通常识别位点位于切割位点之外,因此,通过序列设计,改造完成的质粒在使用这类限制酶切割时,可产生带有完整且单独的poly(A)结构,对下游mRNA的稳定性更加有利,且消除了poly(A)后多余序列的影响。此外,3'突出末端序列可增加副产物dsRNA的产生,增加mRNA产物的免疫原性,对后续的给药临床阶段带来困难。

04

尽可能选择反应温度为37℃的酶

对于工业化生产,温度控制是一项比较繁琐的过程,大多数生物反应因为酶的参与需要在37℃进行。某些特殊的限制性内切酶要求更高的温度,实质上,此类限制性内切酶并不适用于工艺放大,因此在内切酶的选择上,尽可能选择反应温度在37℃的酶,更有利于工业化生产。



宝锐生物致力于服务mRNA疫苗技术的发展,自主研发并推出GMP级别的BsaI和BspQI限制性内切酶,两种酶的识别和切割位点如下:


BsaI:5'.......GGTCTC(N)↓.....................3'


3'........CCAGAG(NNNNN)↑.......5'


BspQI:5'.......GCTCTTC(N)↓....................3'


3'.......CGAGAAG(NNNN)↑..........5'


宝锐生物BsaI和BspQI限制性内切酶经过严格质控监测,确保符合国家药用级辅料质量要求,为客户提供优质的上游酶原料。



更多限制性内切酶(Xhol、 EarI等)

即将上市,敬请期待!


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