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【5分钟讲透实验】影响PCR实验结果的因素综述

2023-08-16 10:14:48

文章来源:晶莱生物


聚合酶链式反应

(PolymeraseChainReaction,PCR),是用DNA聚合酶在体外对特定的DNA片段进行快速扩增的方法。

该方法特异性高、敏感性强、操作简单、快速,不通过活细胞,在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增10~109倍,现已广泛应用到分子生物学研究的各个领域。



操作人员

PCR技术是成熟的诊断技术,无论是PCR特异性还是PCR扩增效率都是很成熟的。应该认真对待每一步操作、每个小细节,因为该方法与以往的其他检测项目相比,有许多特殊的地方。

如敏感性很高,要注意操作和试剂污染问题;整个反应微量,要求操作很精细,取样量很少,吸头多沾一点可能改变整个反应体系成分比例,从而影响PCR扩增的准确性。

根据检测经验,PCR检测需要一点点熟练和领悟,需要技术人员有一个操作技术的稳定过程。

对于PCR检测中出现的问题,首先应寻找操作人员的自身原因。



PCR技术操作的影响因素及注意事项

PCR只需几个DNA分子做模板就可大量扩增,应注意防止反应体系被少量DNA模板污染和交叉污染,这是造成假阳性最大的可能。

1. 使用PCR室前认真洗净手,操作应戴手套并勤于更换。

2. 成套试剂,小量分装,专一保存,防止他用。配制试剂用新器具,用后做一次性处理。

3. 使用完后切记开紫外15~30min,尤其是配液室;试验完毕要收拾台面,这一点对PCR试验来说尤其重要,因为试验垃圾可能是其他人的污染源,即使不是,未弃的垃圾易成为空气中可能存在的DNA气溶胶的载体,而造成污染。

4. 试剂管用前先瞬时离心(10s),使液体沉于管底,减少污染手套与加样器的机会。

5. 加入模板切忌喷雾污染,在吸取液体时,尽量避免用力过快吸取。避免反应成分或模板喷到移液器上,污染移液器和环境。所有非即用管都应盖严,加模板DNA后应更换手套。

6. 准确吸取各反应成分,配反应液时要尽量避免1~2μL量加入,避免配单个20μL反应体系。浓度高的液体在应用之前稀释至适当浓度,然后再加入反应体系中。做多管PCR反应时首先将除模板之外的其他成分混合一起,然后再分成单个PCR反应管中,这样,加入各成分的量比较准确。

7. 电泳时注意事项电泳上样时,避免PCR产物漂移到其他孔而影响结果判定。特别要注意EB为强致癌物质,必须戴手套,谨慎操作,摇动时不要外溅。


常见问题及解决方法

1. 阴性对照和阳性对照都出现阳性扩增带

原因:

①阴性样品和PCR反应试验污染。

②电泳上样时避免PCR产物漂移到其他孔而影响结果判定。

解决方法:

①更换全部试剂,必要时更换所有移液器。

②应小心操作,或琼脂糖凝胶加厚,增加每孔的容量,可避免加样液的溢出。


2. 阳性对照呈阴性

原因:

①阳性样品或加入阳性模板失效。无论是组织还是血清,冻融1次后病原数量明显减少。

②加入试剂量不准确或遗忘了某一成分。

解决方法:

①将阳性对照样品分成小包装。每个包装够用1次最好。

②仔细核对试验记录,校对移液器。


3. 阳性对照扩增带弱

原因:

电泳时琼脂糖中核酸染料含量少或长时间后再用已失效。

扩增效率不高的原因有:

①反应体系问题,操作中加入缓冲液、TaqDNA聚合酶、引物等不准确,造成不能达到最佳反应体系。

②仪器不能正常工作。

③样品处理过程中残留有较多PCR反应抑制物造成的。总之,多数情况是由于操作者怕PCR不出阳性,有意无意提高PCR检测样品量造成的。

对策:

①是将琼脂糖凝胶放入含有EB电泳液中再染30min后再观察。

②检测仪器是否正常工作。

③增加纯化DNA或cDNA样品的稀释倍数。


4. 出现非特异扩增带(除了阳性带之外样品出现了许多扩增带)

原因:

①样品模板量过多。

②引物或TaqDNA聚合酶多。

③Mg²+浓度过高或退火温度过低。

对策依据具体实验的情况,分析上述可能出现的原因,采取相应的措施。


5.避免假阳性及污染可采取以下措施

5.1分室( 区) 操作:样本处理包括取样、核酸提取与准备试剂

PCR 反应及产物鉴定均应分室( 区) 及分人操作,这是由于污染可能通过样品中经常发生的雾化,如煮沸、震荡、离心等,雾化的颗粒直径可达20μm,体积超这样大小的微粒可含4000个拷贝的扩增产物,因此就尽量在通风厨内内操作。

防止污染的最重要的措施是 PCR 准备过程要与同 PCR 扩增产物有关的任何操作完全分开,避免扩增产物与反应物品相接触。


5.2设对照:每次 PCR 反应均应设阴性和阳性对照。

阴性对照要包括无 DNA 的重蒸水及已知阴性对照 DNA 对照;阳性对照是判断结果的简易方法。尤其是开始做某种 PCR或建立方法时,但阳性对照的扩增产物可能成为以后实验中引起假阳性的根源。 

因此,目前认为一旦方法成熟就不在设阳性对象,可以从扩增片段的大小或 southern 杂交法判定结果,检测外源 DNA 如微生物 DNA,可用有关的 DNA 克隆片段或基因组做阳性对照。 

若无,可用书籍阳性的标本代替。


5.3其它操作:

PCR 扩增和样本处理最好有不同操作者进行,操作人员应戴手套、帽子,并尽量戴口罩、穿隔离衣。

试剂操作应尽量减少,对二次扩增即 PCR 的操作要特别严格。作为检测用时,循环次数尽量减少。 

涉及到 PCR 的离心管、TIP头尽可能一次性使用,开启离心管、加样、取样时要轻柔,避免加样器头部污染,PCR 有关试剂都要装成小管,使用时尽量不要反复多次,一旦有污染的证据即要丢弃。


6. 假阴性可采取以下措施

6.1 阴性不同于扩增失败,扩增失败有多种原因:

主要技术性的如引物、酶、缓冲液、dntps 是否加入,各成份是否失败,反应体积是否准确,DNA 是否变性,解链是否充分等。

有二种情况扩增反应可能记为阴性结果,即假阴性,其一是检测某种外源特异 DNA 顺序,如病毒、细菌、支原体等。

微生物是否存在基因缺失时,其反应失败误会错误的提示存在缺失。其二,用3`端错配等位基因特异引物分析单个碱基突变性,扩增失败可能提示引物不能完全与模板退火,并根据失败可能提示引物不能完全与模板退火,并根据失败的反应是用突变引物还是正常引物,把杂合子误为纯合子或正常基因。


6.2 避免假阴性可用另一对引物扩增基因组中其它区域的不同长度的 DNA 作为对照。

PCR 反应结束后,测量对照DNA 条带大小可表明扩增是否成功,这也不能排除技术性原因导致的失败。 

假设阴性对照可验证引物,但又增加了污染的可能性,引物对照也增加了 PCR 的费用及反应准备时间,在实际应用中可酌情考虑。 

当然,对某些阴性结果有怀疑时,也可重复一次 PCR,包括样本处理步骤。

PCR 反应具有较大扩增能力与极高的灵敏性的特点,但极容易污染,造成假阳性和假阴性。

要时刻注意污染的监测,考虑有无污染,是什么造成的污染,便采取措施,防止和消除污染,保证结果的正确性。


实时荧光PCR在实际操作中一定要严格按照标准操作程序进行操作,尽量消除影响检测结果的因素,确保检测结果的准确性。


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