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qPCR实验中引物设计的详细步骤介绍

2023-08-18 14:57:36

文章来源:red red sea Super Lab


qPCR实验中,引物设计是非常重要的一个环节,引物的合适与否与扩增效率是否达标、扩增产物是否特异、实验结果是否可用等息息相关。

您是不是在qPCR引物设计中感到困惑:如何使引物特异性最佳?有没有什么一劳永逸的方法?在设计qPCR引物时,通常要留意以下几点:


  • 引物尽量要跨内含子设计

  • 产物长度100-300 bp

  • TM值尽量接近60℃且上下游引物尽量接近

  • 引物末端最好是G或C


第一步:查询基因

通过NCBI查询Homo GAS6的基因,这里要注意对比基因名称、种属,确保都要一致。

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第二步:找到基因序列

1.若目标序列为基因组DNA,则选择第一个,为该基因的基因组DNA序列。若目标序列为mRNA,则选择第二个。


 image.png

2.进入后,点击如下表的“CDS”,棕色背景序列即为该基因的编码序列。

image.png


第三步:设计引物

1.进入Primer-BLAST界面。

image.png


2.在左上方输入基因序列号或Fasta格式的序列,填写好相关参数。

image.png


3.点击“Get primers”NCBI就会弹出来告诉你,这样的参数选择会扩增到其他剪切变体,我们勾选不同的剪切变体并提交,就可以获得合适的引物对了!(如下图)

image.png


这些引物对的退火温度,都在60℃左右。根据实验目的,选择长度适中、特异性好和引物自身互补较少的引物进行实验,成功率还是相当高的呢!
 

第四步:引物特异性验证


Primer-Blast除了可以设计引物外,还可以对我们自己设计的引物进行评价。返回引物设计的页面,输入我们设计好的上下游引物,其它参数不调整,提交后就可以看到这对引物是否在其它基因上也存在啦,如果全部都显示在我们想要扩增的基因中,说明这对引物的特异性棒棒哒!(举例引物查询结果只此一条噢!)

image.png


第五步:引物质量判断


怎么样的引物才是集“扩增效率达标”、“扩增产物特性好”、“实验结果可靠”于一身呢。

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引物的扩增效率达到90%-110%即认为扩增效率较好,熔解曲线单峰且通常Tm>80℃即认为扩增特异性较好。相当简单有木有啊~是不是感觉自己已经告别科研小白的身份,瞬间掌握了qPCR引物设计的绝招啦。




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