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T7 RNA Polymerase 3.0→37℃转录,大幅降低dsRNA副产物

2023-09-01 15:07:01


T7 RNA聚合酶,精确识别T7启动子区域(5’-TAATACGACTCACTATAG-3)从此区域的G开始,将后续的DNA序列转录成单链RNA。

体外转录的RNA广泛的基础科学和应用技术领域:结构研究、基础RNA生物学、CRISPR、lncRNA、mRNA疫苗和mRNA疗法、siRNA等。各类项目对RNA的纯度有不同需求

目前T7 RNA聚合酶能有效、快速、高产地提供RNA的体外合成,但有时会出现dsRNA副产物。部分RNA序列在被转录过程中形成局部空间结构,尤其是3'端出现发夹结构容易导致T7 RNA聚合酶以RNA为模板继续延伸,导致dsRNA产生。

RNA 治疗应用中,来自体外合成 RNA 的 dsRNA 污染可以引发先天免疫反应,因为 dsRNA 对多种生理生化的信号通路产生影响,视黄酸诱导基因 (RIG-I)、Toll 样受体 3 (TLR-3) 和蛋白质黑色素瘤分化-相关抗原 5 (MDA5) 。

它可以引起 I 型干扰素的产生,通过激活和上调蛋白激酶 R (PKR) 来抑制翻译,还可以通过激活 2'-5' 寡聚腺苷酸合成酶 (OAS) 酶家族来引起细胞 mRNA 降解。


因此,对体外转录的mRNA,减少dsRNA污染尤其重要。凝胶或色谱纯化方法非常耗时,且不精确,RNA长度越长分离效果会越差,无法纯化精确编码的 RNA。


2019年一篇文献报道一种方法:dsRNA在16%乙醇缓冲液,与纤维素有更强的结合能力,通过J2抗体检测,该方法可以有效去除dsRNA杂质( 1 )。文章介绍此方法在30–1,000 bp范围内的dsRNA能被有效去除,且能高效回收mRNA。

但纯化1K至2kb的mRNA时回收率会降至65-85%,长的mRNA链可能会有自身的局部双链二级结构,在与纤维素结合时可能不利于长链mRNA的回收。对部分本身含有天然双链二级结构的RNA回收不利,且在长链的mRNA回收时可能会造成大量损失。


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图1 通过纤维素层析从IVT mRNA中去除长dsRNA



(A图)在1Kb长的m1Ψ mRNA中,掺入0.02–20 ng dsRNA/μg mRNA。使用 0.14 g纤维素的离心柱,纯化100 μg上述含dsRNA杂质的RNA样品。然后,使用J2 dsRNA特异性抗体进行斑点印迹。


(B图) 在1Kb长的m1Ψ mRNA中,掺入0.5–25 ng dsRNA/μg mRNA。分别测试未结合纤维素的mRNA (B图-boud) 经过0.14 g纤维素的离心柱纯化的mRNA (B图-unbound)。再使用J2 dsRNA特异性抗体进行斑点印迹。

2021年一篇文献介绍,一种固定化DNA转录模板,在高盐环境下能有效减少dsRNA的产生(2). 其介绍,增加盐浓度会破坏T7与启动子DNA结合的能力,同时也会抑制T7酶与产物RNA重新结合的稳定性。

在T7酶的N端与模板DNA共价交联下,会在其结合位点附近产生局部高浓度的启动子,即使在高盐环境下也能与T7启动子结合。

而高盐环境下,T7酶转录到RNA的3’端也无法与产物 RNA 重新结合,避免顺式引物延伸活性,大大减少更长的双链 RNA 杂质的产生。

具体方式:在非模板链进行 5'-生物素化,T7酶添加 Strep-tagII肽标签。启动子复合物与Strep-TactinXT包被的磁珠一起孵育,形成图2所示的Tethered体外转录系统。

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图2

在该系统下,T7酶能耐受0.1-0.4M的NaCl浓度进行高效的体外转录。


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图 3(图A / 图B)


图A和图B:Tethered体外转录系统,T7酶在0.1-0.4M NaCl条件下能有效转录,而unTethered的普通体外转录则会大幅降低转录产量。且Tethered体外转录系统主条带上方的dsRNA比unTethered更少,能有效减少dsRNA产生。该文献介绍的Tethered T7转录系统是减少dsRNA产生,弥补第一篇文献中,纤维素膜方法不利回收天然存在局部双链二级结构RNA的缺陷。但该文献中实验所测试的RNA是24nt的短RNA,未对常规的长链mRNA转录做描述。


两篇文献分别介dsRNA的去除和dsRNA产生避免,具有创新性,为工业化大规模体外转录反应提供宝贵思路。


宝锐生物T7RNA聚合酶




在mRNA药物制备过程中,要减少dsRNA副产物,还需从根源着手,通过更优质的反应体系和优秀的酶在转录反应过程中减少dsRNA副产物

市面上多种耐热T7 RNA聚合酶通过提高T7的热稳定性,在高温 (42℃-50℃)下进行转录,从而减少dsRNA的生成。这一策略虽有效果却也在工业应用端受限严重;主要问题在于高温转录单个反应产量较低、工业制备mRNA原液时对高温温控更复杂以及多种mRNA制药项目不适用高温反应等。

宝锐生物经多轮筛选,推出可大幅度减少dsRNA产生的T7 RNA Polymerase 3.0,斑点印迹显示dsRNA大幅度少于不同类型竞品T7 RNA Polymerase,且无需50℃反应,37℃反应温度下即可高产、稳定转录出低含量dsRNA的mRNA。


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图4 使用J2 dsRNA 特异性抗体对dsRNA标准品进行斑点印迹


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图5 斑点免疫印迹测试不同厂家T7转录产物


斑点印迹作为一种dsRNA含量定性检测方法,对比图4与图5可直观看出,宝锐T7 RNA Polymerase 3.0能有效降低dsRNA的产生,在等量转录产物中检测到的副产物dsRNA含量远少于常规T7与耐高温T7竞品组,且单个转录体系下宝锐T7 RNA Polymerase 3.0与竞品A产量相近(图6)。

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图6 不同类型T7 RNA Polymerase转录产量对比

使用双抗体夹心酶联免疫法体对不同类型T7转录产物mRNA原液中dsRNA进行定量检测(图7),宝锐T7 RNA Polymerase 3.0转录制备的mRNA中仅检测到0.48μg/mg的dsRNA,已达到IND申检dsRNA残留项的要求(1μg/mg),可以有效减少免疫原性,为mRNA疫苗与药物的研发提供助力(表1)。


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图7 双抗体夹心酶联免疫法检测dsRNA标曲

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表1 不同类型T7应用体外转录


未来,宝锐生物将持续研发迭代更优质mRNA各类酶原料,努力为mRNA疫苗行业发展提供助力!


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参考文献:

1:A Facile Method for the Removal of dsRNA Contaminant from In Vitro-Transcribed mRNA.Mol Ther Nucleic Acids. 2019 Apr 15; 15: 26–35.doi: 10.1016/j.omtn.2019.02.018

2:High-salt transcription of DNA cotethered with T7 RNA polymerase to beads generates increased yields of highly pure RNA.J Biol Chem. 2021 Sep; 297(3): 100999.doi: 10.1016/j.jbc.2021.100999



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