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DNA聚合酶保真度常见检测方法介绍

2023-09-20 17:07:12




常见方法

蓝白斑筛选

Sanger测序

NGS测序





聚合酶链式反应(PCR)是一种在体外扩增放大特定核酸片段的分子生物学技术,在生命科学研究领域应用广泛。但由于DNA聚合酶在体外合成过程中会产生错配,且随着扩增反应的发生会被逐级放大最终将影响结果的准确性。特别是在克隆、定点突变、测序模板制备以及基因变异性研究等应用过程中,保持在PCR扩增过程中的DNA序列准确性尤为重要。


DNA聚合酶精确复制DNA模板的能力称之为“保真度”,在PCR扩增过程中部分聚合酶可以精确读取和复制模板序列并优先结合正确的核苷酸,从而实现精准扩增。这是因为此类DNA聚合酶具有3′→5′核酸外切酶活性,当不正确的碱基掺入时聚合酶会识别错误核苷酸并将之切除,重新聚合正确的核苷酸

DNA聚合酶的5′→3′聚合活性位点与3′→5′核酸外切酶活性是相分离的,在扩增过程中当错误的核苷酸掺入时DNA合成会因碱基配对动力学影响发生暂停,此时3′ → 5′核酸外切酶将会切除错配碱基并替换为正确的核苷酸。

图1 DNA聚合酶及其5′→3′聚合酶结构域和3′→5′核酸外切酶结构域(源于网络)


错配率常被用来作为比较不同DNA聚合酶保真度的指标,错配率越低保真性越好。错配率是指在PCR产物中发生错配的核苷酸数目与聚合的总核苷酸数目的比值,所以DNA聚合酶的保真度与PCR扩增子长度和扩增循环数密切相关,因此在比较不同种类DNA聚合酶的保真度时必须使用相同的方法与参数进行扩增


DNA聚合酶保真度的检测方法有很多种,包括恒定变性毛细管电泳(CDCE)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、PCR/RFLP、蓝白班筛选、Sanger测序和NGS测序等。但常见的测定方法主要有蓝白班筛选、Sanger测序和NGS测序三种,其测定原理与操作步骤如下:

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蓝白斑筛选测定保真度

蓝白斑筛选是利用lacZ基因编码的α肽链(酶的N端)与β-半乳糖苷酶缺陷型菌株表达的β-半乳糖苷酶的C端互补,形成具有活性的β-半乳糖苷酶从而具有分解X-gal生成蓝色物质的能力对DNA聚合酶保真度进行测定。


操作步骤 


1

使用待检测DNA聚合酶扩增LacZα基因

2

将获得的LacZα基因连接到线性载体上形成重组质粒;

3

将重组质粒转化宿主菌并涂平板培养;

2

统计蓝斑与白斑数目计算错配率。


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图2 蓝白斑筛选检测保真性的步骤源于网络)

常见的β-半乳糖苷酶缺陷型菌株有DH5α、TOP10等,适用于蓝白斑筛选的载体有pUC系列(pUC18 ,pUC19)、M13mp系列等。

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Sanger测序测定保真度:

Sanger测序是一种是通过单菌落进行测序,进而对发生错配的核苷酸数目统计分析验证DNA聚合酶保真度的方法


操作步骤 


1

使用待测聚合酶对DNA模板进行PCR扩增

2

将PCR产物克隆到载体上,并转化宿主菌涂平板培养;

3

从平板上挑取单菌落进行大批量测序;

2

统计错配核苷酸数目计算错配率。

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图3 Sanger测序检测保真性的步骤(源于网络

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NGS测序测定保真度

NGS测序测定保真度是一种利用NGS平台对待测DNA聚合酶扩增出的PCR产物进行测序分析,通过统计发生错配的核苷酸数目计算DNA聚合酶保真度的方法。

操作步骤:1.根据模板设计PCR扩增引物;2.使用待测的DNA聚合酶进行PCR扩增;3.使用试剂盒对PCR产物打断建库后上机进行双向测序;4.筛选正反两个方向突变相同的位点进行统计并计算错配率


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图4 NGS测序检测保真性的步骤(王金,2017


三种方法优缺点:

image.png



参考文献:

1.耿亮. 一种DNA聚合酶错配率的检测方法 , CN104894221A. 2015

2.齐鸿雁. 变性梯度凝胶电泳检验DNA聚合酶在PCR中的错配率 , CN1438483A. 2003.

3.王金. 一种检测DNA聚合酶保真度的方法:, CN106701896A[P]. 2017.

4.Keith BJ, Jozwiakowski SK, Connolly BA. A plasmid-based lacZα gene assay for DNA polymerase fidelity measurement. Anal Biochem. 2013 Feb 15;433(2):153-61.

5.Cline J, Braman JC, Hogrefe HH. PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. Nucleic Acids Res. 1996 Sep 15;24(18):3546-51.

6.Lundberg KS, Shoemaker DD, Adams MW, Short JM, Sorge JA, Mathur EJ. High-fidelity amplification using a thermostable DNA polymerase isolated from Pyrococcus furiosus. Gene. 1991 Dec 1;108(1):1-6.


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