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学术|核酸适配子筛选的浅析

2023-12-01 10:35:46



前 言

核酸适配体 (Aptamer) 是一种能和靶分子特异性结合的单链寡核苷酸。其通过核苷酸碱基互补配对、氢键、π-π堆积、静电作用力等多种相互作用力发生自身适应性折叠后形成特定的三维结构,这种三维结构通过分子间作用力与靶分子特异性结合。

其结合解离常数能达到纳摩尔和皮摩尔水平,与单克隆抗体相当。主要涉及蛋白质组学、生物检测、分子检测、靶向治疗、药物递送、生物传感器、食品安全、分子影像、疾病诊断治疗、基因调控、药物研发、纳米材料和生态环境等众多领域。具有高亲和力和强特异性、适配体性质稳定、结构稳定、不易受外界环境干扰,可重复利用、不会对实验对象产生免疫影响、粒径小、可与多种靶标识别、易于标记和修饰、合成成本低。





目前筛选核酸适配体最有效的工具就是SELEX技术。

SELEX技术是指一种指数富集的配体系统进化技术 (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),能在体外筛选获得可与靶标高特异性和高亲和力结合的单链DNA(ssDNA) 或RNA。其步骤一般包括随机文库的合成、固相与靶标的锚定、dsDNA和ssDNA的制备等,为了更好的筛选出我们所需要的核酸适配体,下面将对这三个方面进行详细介绍:


计随机文库也要注意以下几点要求:


01

随机文库一般选择ssDNA而不选择RNA。首先,DNA在化学和生物上更稳定,这使得选择和应用都更容易。当微阵列平台应用于高通量SELEX时尤其如此;其次,基于DNA的SELEX更具成本和时间效益,因为不需要RNA SELEX所必需的额外逆转录步骤;第三,从商业化的角度来看,就保质期而言,DNA比RNA更容易合成,也更坚固 (Lakhin et al.,2013)。



02

在设计随机文库时应尽量设计短一些,但是也不能太短。因为短的随机序列合成简单且成本较低;其次 形成PCR副产物的可能性降低;以及促进随后的序列截断和应用。为了与常见的PCR聚合酶兼容,随机区域一般设计为30–50 nt(Cowperthwaite and Ellington et al.,2008)。




目前的SELEX方案通常通过固体底物固定靶标,包括磁性颗粒(Bruno et al.,1997)、琼脂糖(Soldevilla et al.,2017)、琼脂糖基树脂(Kowalska et al.,2014),微流体芯片(Olsen et al.,2017)或玻璃盖玻片(Lauridsen et al.,2012)。


在这些固相中,磁珠可能是使用最多的。一般是利用蛋白质上的氨基与磁珠上的羧基发生偶联反应从而形成共价键,最后形成一个固相将蛋白质锚定在磁珠上。然后利用随机文库和目标蛋白与羧基磁珠偶联复合物结合;最后利用特定的盐离子将未结合ssDNA清洗干净,这样就能够使特异性ssDNA与蛋白质结合在一起,最后再利用某种方法将特异性的蛋白洗脱下来并收集ssDNA。





制备dsDNA时最常用的方式就是通过聚合酶链式反应(PCR),但是在进行PCR时会存在碱基偏倚现象,SELEX中反映了“适者生存”的规律,即通过聚合酶链式反应仅富集和扩增与感兴趣的靶标表现出强结合的文库序列。

理想情况下,为了从初始文库中有效地选择最佳的结合物,在PCR扩增后,PCR扩增子中不同序列物种的比例应该忠实地反映原始模板的组分组成。然而,长期以来一直观察到,与扩增同质模板不同,具有高多样性的复杂寡核苷酸文库的PCR扩增非常复杂(Polz and Cavanaugh et al.,1998)。由于初始文库中的每个序列都具有不同的结构特性,如GC含量、二级结构和熔融温度,因此它们表现出对DNA聚合酶、引物和其他PCR条件的适应性。

在过去的几年里,NGS技术的快速发展导致了一种称为乳液PCR(ePCR)的新型PCR变体的发明(Kanagal-Shamanna et al.,2016),通过将每个寡核苷酸序列封装到被疏水有机相包围的单个PCR液滴中,ePCR能够将PCR偏差和副产物的形成显著降低到不可检测的水平。


然而,利用ePCR扩增得到的dsDNA产物必须通过变性PAGE凝胶进行分离,以分离不同分子量的dsDNA、ssDNA和引物,然后进行洗脱步骤以提取预期的ssDNA,但是这种获得ssDNA的方式比较耗时,目前用链霉亲和素包被的珠子进行磁性分离(Shigdar et al.,2013b)的方法同样是迄今为止最广泛使用的策略(Svobodova et al.,2012)。
简言之,在PCR过程中,将对应于不期望序列的引物进行生物素化,然后将生物素化的PCR产物固定在链亲和素珠上。在碱性变性步骤之后,所需的非生物素化ssDNA能够从生物素化链/链亲和素珠中分离出来,并洗脱到溶液中。在磁珠的帮助下,这种方法的整个过程非常简单,通常只需20分钟。
然而,积累PCR副产物的趋势对该方法的应用提出了另一个挑战,由于PCR产物与链霉亲和素珠的结合是由其生物素部分决定的,具有更多的生物素分子,因此与正常PCR产物相比,链霉亲和蛋白珠对PCR副产物表现出更强的结合偏好。
此外,这种副产物的长延伸允许在PCR过程中进行更有效的退火(Tolle et al., 2014),如果没有有效的程序将它们从反应中去除,它们可能会随着SELEX的进展而积累,并最终主导PCR产物,这会导致出现超出预期的结果。



The End




参考文献:

1.Lakhin AV, Tarantul VZ, Gening LV. Aptamers: problems, solutions and prospects. Acta Naturae. 2013 Oct;5(4):34-43.

2.Cowperthwaite MC, Ellington AD. Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures. J Mol Evol. 2008 Jul;67(1):95-102.

3.Bruno JG. In vitro selection of DNA to chloroaromatics using magnetic microbead-based affinity separation and fluorescence detection. Biochem Biophys Res Commun. 1997 May 8;234(1):117-20. 

4.Soldevilla MM, Hervas S, Villanueva H. Identification of LAG3 high affinity aptamers by HT-SELEX and Conserved Motif Accumulation (CMA). PLoS One. 2017 Sep 21;12(9):e0185169.

5.Kowalska E, Bartnicki F, Pels K. The impact of immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resins on DNA aptamer selection. Anal Bioanal Chem. 2014 Sep;406(22):5495-9.

6.Olsen T, Zhu J, Kim J. An Integrated Microfluidic SELEX Approach Using Combined Electrokinetic and Hydrodynamic Manipulation. SLAS Technol. 2017 Feb;22(1):63-72.

7.Lauridsen LH, Shamaileh HA, Edwards SL. Rapid one-step selection method for generating nucleic acid aptamers: development of a DNA aptamer against α-bungarotoxin. PLoS One. 2012;7(7):e41702.

8.Polz MF, Cavanaugh CM. Bias in template-to-product ratios in multitemplate PCR. Appl Environ Microbiol. 1998 Oct;64(10):3724-30.

9.Kanagal-Shamanna R. Emulsion PCR: Techniques and Applications. Methods Mol Biol. 2016;1392:33-42.

10.Shigdar S, Qiao L, Zhou SF. RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133. Cancer Lett. 2013 Mar 1;330(1):84-95.

11.Svobodová M, Pinto A, Nadal P. Comparison of different methods for generation of single-stranded DNA for SELEX processes. Anal Bioanal Chem. 2012 Aug;404(3):835-42.

12.Tolle F, Wilke J, Wengel J. By-product formation in repetitive PCR amplification of DNA libraries during SELEX. PLoS One. 2014 Dec 9;9(12):e114693.

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