PRIMER DESIGN TOOL
引物在线设计工具
按最近邻法计算引物 Tm，检查错配和二聚体，在模板上定位引物、估算产物长度，多对引物可以从 Excel 导入、结果导出。
反应条件 引物总浓度 500 nM · Na⁺ 50 mM 修改收起
常用条件
「引物总浓度」和 Primer3 里的引物浓度是同一个口径。改了条件，已有的结果会跟着重算。
序列只在您的浏览器里计算，不会上传到服务器。
METHOD
计算方法
- Tm
- 最近邻法（nearest-neighbor），热力学参数用 SantaLucia 1998 统一参数，Primer3 等常用工具用的也是这一套。
- 盐校正
- 默认用 Owczarzy 2008，Mg²⁺ 和 dNTPs 都计入（dNTPs 会结合一部分 Mg²⁺）；也可以换成只看一价离子的 SantaLucia 1998。Tris 按浓度的一半折算成一价离子。
- 错配
- 内部错配和次黄嘌呤用 Allawi、Peyret、Watkins 与 SantaLucia 发表的参数，末端错配用 SantaLucia 与 Peyret 的参数。相邻两个错配这类没有实测参数的组合按平均值近似，结果偏粗。
- 简并碱基
- 按每个位置可能出现的碱基取平均，N 按 A、C、G、T 各占四分之一计算。
- GC 含量和分子量
- GC 含量按碱基数计算；分子量按不带 5′ 磷酸的 DNA 单链计算，不含修饰基团。
- 二聚体
- 只看 3′ 端的连续互补：5 个碱基及以上记为高风险，4 个记为中风险。
- 修饰
- 末端修饰、LNA、2′-O-甲基和硫代修饰对 Tm 的影响是经验值，只供参考。
结果是按模型估算的，只供引物设计时参考，实际的退火温度和扩增效果请以实验为准。
FAQ
常见问题
这里算出的 Tm 和别的网站不一样，以哪个为准？
Tm 是按模型估算的，方法和反应条件不同，结果就不同。本工具用最近邻法，默认条件是引物总浓度 500 nM、Na⁺ 50 mM，不含 Mg²⁺ 和 dNTPs。比较两个工具的结果前，先把引物浓度、盐离子、Mg²⁺ 和 dNTPs 浓度改成一样的。
退火温度应该设多少？
一般先从比两条引物里较低的 Tm 低 3–5 °C 试起，再按扩增结果调整。不同聚合酶和缓冲液的推荐值不一样，请以所用产品的说明书为准。
我的引物序列会被上传或保存吗？
不会。所有计算都在您自己的浏览器里完成，序列不发到服务器，关掉页面就没有了。浏览器只记住您上次填的反应条件。
支持哪些碱基和修饰？
支持 A、C、G、T、U（按 T 计算）、次黄嘌呤 I 和 IUPAC 简并碱基（R、Y、S、W、K、M、B、D、H、V、N）。简并碱基按各种可能的碱基取平均。可以选 5′ 和 3′ 端的荧光、淬灭、生物素等常见修饰，以及 LNA、2′-O-甲基和硫代修饰；修饰对 Tm 的影响用的是经验值，只供参考。
二聚体风险的「高」「中」「低」是怎么判断的？
看一条引物的 3′ 端能和另一条引物（或它自己）连续互补几个碱基：5 个及以上记为高，4 个记为中，其余记为低。这是经验规则，用来提醒您留意，不能代替实验验证。
做 PCR、qPCR 要用的聚合酶和预混液，可以到产品中心按应用查找；引物和反应体系有疑问，也可以直接问我们的技术支持。