什么是冻干?
冷冻干燥，全称真空冷冻干燥，简称冻干，是指将含有大量水分的物料预先进行降温，冻结成冰点以下的固体，在真空条件下使冰直接升华。从而去除水分得到干燥产品的一种技术。如今已经广泛应用于食品、药品、生物制品等领域。
不同于食品或宠物零食等冻干产品，往往只需要将水分去除以便更好地保存和运输；常规体外诊断检测试剂中含有生物活性成分(各种酶类及蛋白类添加剂等)，除了应对运输的需求，还需要确保其在冻干复溶后仍然能够正常工作，并且功能可以和冻干前的液体试剂保持基本一致。
然而整个冻干过程中存在许多应力，包括低温应力、冻结应力(枝状冰晶的形成、离子强度的增加、pH值的改变、相分离等)、干燥应力(失去蛋白质表面水分子)等，这些应力常常直接或间接导致蛋白质类等活性组分失去天然构象从而变性或失活。那么这时候就需要冻干保护剂来对这些活性组分进行保护了。
除了功能性，冻干后的形态是否正常也是冻干成功的指标之一
冻干保护剂对于蛋白质的保护原理已经被研究讨论了几十年，虽然没有形成统一的理论，但还有一些被普遍接受的认识。冻干保护剂在冷冻干燥过程中的冻结与干燥阶段对于蛋白质的保护作用原理不同。
在冻结阶段，最主要的假说为“优先化作用”，即蛋白质周围有一层水化层，可以保持其性质及构象的稳定。其中有两个优先，“优先水合”和“优先排斥”。
蛋白质溶液在达到最大冻结浓缩浓度以前优先与水作用并排斥保护剂分子，蛋白质化学势增加，表面有更多水分子，保护剂加入后可能与蛋白质表面或个别氨基酸、肽主链等位点发生非特异相互作用，优先从蛋白质表面进入溶液中，保护了其天然构象。
在干燥阶段最主要的有2种假说，即“玻璃化”和“水置换”。
所谓玻璃化是指物质以非晶态形式存在的一种状态，黏度极大，具有液体的性质，但由于黏度大，分子运动受到限制，流动性差。玻璃化状态与温度密切相关，当溶液浓度达到最大冻结浓缩状态发生玻璃化转变时的温度称为玻璃化转变温度(Tg )。
在冻干过程中，如果温度高于产品的Tg，就会使产品黏度迅速降低，表面萎缩，微观结构破坏，发生塌陷现象。玻璃化状态保护蛋白质理论的基础是将蛋白质固定在刚性的、非晶态的玻璃糖基质中，分子构象互变及构象松弛减慢，从而维持了分子的结构和功能。
在冻干过程中，蛋白质溶液中的保护剂与蛋白质分子中多个氨基、羟基和羧基之间相互作用，增加了冷冻混合物的玻璃化转变温度，大大增加蛋白质的稳定性。
水置换理论是指在干燥过程中，保护剂会与蛋白质形成氢键，从而取代水和蛋白质之间的氢键，这样可保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，通过这种替代的氢键使蛋白质的天然构象得以保持。
过去，较多研究者赞同“水置换”假说。但Grasmei-jer等发现，在蛋白质冻干制剂的贮藏过程中，只要有足够高的玻璃化转变温度，即Tg比贮藏温度高10～20℃时，水置换是主要的稳定机制；然而，当储存温度接近或超过Tg时，玻璃化成为稳定的限制因素。这说明保护剂对蛋白质的保护是一个复杂的问题，没有一个统一的理论能够完全解释，蛋白质在各种过程中的稳定机制，不能用一种假设来解决。
海藻糖在失水状态下对结构的维持作用
不管是何种假说，对于冻干保护剂应该遵循的原则是基本一致的：防止活性组分变性。
按照功能可以把冻干保护剂分类，包括5类：
① pH缓冲剂，如三羟甲基氨基甲烷(Tris)、组氨酸、枸橼酸等;
② 配体，可以优化蛋白质的热力学稳定性;
③ 稳定剂，一般是双糖，如蔗糖、海藻糖等，可通过抑制蛋白质的展开和提供玻璃基质起保护作用;
④ 非离子表面活性剂，可减少蛋白质的聚集;
填充剂，如甘露醇、甘氨酸、羟乙基淀粉、血清白蛋白等，可提高产品的物理成型性。冻干物料总的固态成分小于2%时通常需向其中加入填充剂。
1. 保护剂的成分不影响pcr反应本身，或者最大程度避免反应体系受到抑制。
2. 保护剂作为固剂在升华时不会崩塌，保护酶活性同时保证了冻干制品的形态。
3. 冻干后的制品干燥疏松多孔结构，使得复溶过程时间缩短。
4. 冻干后真空储存，可在室温下长期保存。
1. 保护剂兼容性不足，在面对复杂的体系或者存在低Tg组分时易导致冻干失败。
2. 由于结构的疏松多孔，复溶快速的同时也存在易快速吸潮，引起活性成分活性丧失。
3. 成分较为单一，难以兼顾各个评价指标。例如出箱形态正常，但在面对37℃或45℃甚至更高温度的加压测试下容易出现萎缩的情况。
上述缺点中大多集中在功能性验证上的攻克上，但是往往忽略了一个重要的问题，就是冻干结构带来的极易吸潮的特点。传统的医药类生物冻干制品主要是在西林瓶中进行冷冻干燥的，冻干完成后，利用冻干机板层的升降来进行压盖，完成西林瓶的初步密封，随后出仓转移到低湿车间内进行二次密封。然而，对于分子诊断试剂而言，其冻干容器往往是PCR管、8连管、96孔板等，是非传统冻干用的标准容器，进一步提高了自动压塞的门槛，往往需要出仓后进行人工加盖封装。而如果是将反应试剂制备成冻干球，则需要冻干出仓后的分装操作，将冻干球分装到检测容器内进行加盖密封。因此，对这些无法在冻干机内进行压盖的产品，需要在出仓时、分装时、加盖时均在低温低湿的环境(通常湿度要求10％或更低)中进行。
为了达到这样的要求，要么进行全车间湿度、温度控制，这样极端的温湿度控制会造成极大的能源消耗；要么定制隔离罩或手套箱等，通过向隔离罩或手套箱通高纯度惰性气体来降低湿度。但隔着厚厚的手套进行分装、加盖等操作，会极大降低生产效率。而且在产量较高的情况下，需要增加人力，如果人员不够，关盖速度慢，同一批次干燥制剂与空气接触的时间不同，造成差异，而且如果长时间暴露在空气中，容易吸潮复水，极大地影响了产品的出现质量。所以在冻干制品中所含的水量越低，其稳定性就越高，但含水量高低，也直接影响着冻干成本。
所以考虑到这些因素，提出了一个要求就是，能否开发一款冻干保护剂，既能继承常规保护剂的优点，同时在一定的湿度条件下敞口放置一段时间后再进行封装，来模拟长时间分装的情景，仍然能够对后续冻干制品的保存有一定的保障。
宝锐生物通过对冻干保护剂的配方进行重新调整和研发，开发了新的抗吸湿冻干保护剂，对搭配新抗吸湿冻干保护剂的冻干品进行室温、20-25%湿度敞口放置4h后再进行盖盖真空包装。
对上述处理的冻干品进行55℃加速30d，形态保持正常且在不同检测体系下的扩增性能仍然能够和液体对照组保持基本一致。
注：
1. 对照组为不加冻干保护剂的液体试剂；
2. 敞口4h加速组：指在25℃、20-25%湿度下，打开盖子敞口4h，再盖上盖子，放入铝箔袋抽真空密封包装，再放入55℃烘箱加速的样品。
★ 20%-25%湿度下，敞口4h后55℃加速28d后性能基本稳定。
注：对照组为不添加冻干保护剂的液体试剂
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