甲基化敏感内切酶在甲基化分析中的应用

表观遗传学是指在基因组的核苷酸序列不发生改变的情况下，生物个体表型却发生了可遗传性变化的现象。DNA甲基化是目前研究最深入的表观遗传修饰，简言之，是指在DNA甲基转移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将活性甲基转移至DNA链中特定碱基的化学修饰过程，在哺乳动物中，主要生成为5-甲基胞嘧啶（5-mC）。

图1-在DNA甲基化催化酶(DNMT)作用下，胞嘧啶甲基化的过程

DNA甲基化可以发生在胞嘧啶的C-5位、腺嘌呤的N-6位、鸟嘌呤的N-7位等，它们分别由不同的DNA甲基化酶催化，生成5-甲基胞嘧啶（5-mC）、N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7-甲基鸟嘌呤（7-mG）。

图2-碱基中甲基化发生的位置示意图

Dam甲基化：在GATC序列中腺嘌呤N6位发生甲基化。

Dcm甲基化：在CCAGG和CCTGG序列中第2个胞嘧啶C5位发生甲基化。

CpG甲基化：在真核生物（如植物和哺乳动物）中，影响酶切最常见的甲基化类型为CpG 甲基化。CpG甲基转移酶将甲基转移到胞嘧啶残基的C5位置。

当甲基化位点与限制性内切酶识别序列发生重叠，大部分酶切会受到阻断或影响。

图3-dam，dcm，CpG甲基化示意图

根据以上内切酶的甲基化敏感性，对部分甲基化敏感的限制性内切酶进行统计和分类，如下表：

备注：下划线表示内切酶识别的序列，彩色标记的碱基表示会发生甲基化修饰的序列。

随着 DNA 甲基化被发现，人们开始不断的探索如何更好更便捷地对 DNA 甲基化进行研究。对于生物体而言，基因位点的甲基化的改变可能会导致基因表达的改变，因此，对于位点上甲基化水平的研究就尤为重要。目前比较常用的就是利用甲基化敏感酶对基因组 DNA 序列进行识别切割的方法对单个位点的甲基化水平进行研究。

甲基敏感的限制性内切酶 PCR（Methyl-Sensitive Restriction Enzymes PCR）：该方法较为久远，原理是甲基化敏感酶（如 HpaⅡ）对酶切位点中的 CG 甲基化敏感的特性，如果酶切位点的 CG 属于低甲基化，则可以被切开，PCR 扩增后和对照相比没有条带或者 条带很暗，相反如果酶切位点的 CG 属于高甲基化，则不会被切开，PCR 扩增后和对照 相比条带亮度相当，可以通过电泳的结果快速地判断位点甲基化水平的高低，这种方法操作简单成本低而且结果容易观察。

图4-甲基敏感的限制性内切酶检测DNA甲基化

在上述方法的基础上发展出更精确的甲基化定量分析，即使用荧光定量PCR（qPCR）对甲基化酶切后的底物进行检测。在目标位点侧翼上下游设计PCR引物，未被酶切的DNA可以作为PCR模板扩增，而被切开的DNA理论上无法扩增。剩余未酶切DNA的水平取决于目标位点的甲基化程度，位点甲基化程度越高，能被HpaII切割的片段就越少，可供PCR扩增的DNA模板就越多，在qPCR中就越早检测到DNA扩增（即Ct值越低）。根据这一原理，依据qPCR分析即可测定位点的甲基化状态。

目前比较常用的就是利用甲基化敏感酶对基因组 DNA 序列进行识别切割的方法对单个位点的甲基化水平进行研究。甲基化敏感的内切酶在甲基化分析和检测领域有着广泛的应用。下图展示了甲基化分析方法的发展历程，从液相色谱分析到二维电泳，再到3代测序技术在甲基化分析中的应用，伴随着甲基化测序技术的不断发展，甲基化敏感的内切酶参与的甲基化测序的方法也同样不断更新迭代。

目前主要应用多集中在样品的前处理步骤，通过联合亚硫酸盐测序和高通量测序等各种平台分析，从而进行整体和特定区域的甲基化水平分析。

图6-甲基敏感的限制性内切酶检测DNA甲基化

产品：HinP1Ⅰ, HhaⅠ, AciⅠ, HpaⅡ, BssHⅡ, BsrFⅠ, BspEⅠ.

产品特点

特异性：酶切识别特异性强，产物清晰。

高效率：验证酶切效率高。达到或优于进口产品。

高保真：过夜酶切，星号活性极低。

宝锐甲基化敏感内切酶酶切效率高，酶切产物清晰，酶切产物的条带均一，无非特异性切割，即无星活性现象，达到或优于进口N公司产品。

参考文献：