学术宝地｜酶切法建库：NGS革命的“基因剪刀手”

在酶切法出现之前，NGS建库主要依赖物理打断（如超声波）将DNA片段化。这种方法虽然随机性高，但存在明显痛点：

设备昂贵：一台Covaris超声仪动辄数十万元；

样本损耗大：珍贵临床样本经不起“折腾”；

难以自动化：超声设备难以整合到液体处理工作站中。

更令人头疼的是，无论采用何种建库方法，接头二聚体的形成始终是行业顽疾——这些非特异性连接产物会抢占测序通道，导致有效数据量下降和测序成本增加。

酶切法建库的核心突破在于用生物酶替代物理能量实现DNA片段化。与传统方法相比，酶切法的革命性在于：

片段化与末端修复合二为一：将原本需要分开进行的两个步骤整合为单管反应；

摆脱超声依赖：仅需普通PCR仪即可完成片段化；

微量化操作：反应体系可缩小至传统方法的1/20。

2010年左右，Tn5转座酶的创新应用开启酶切建库先河。这种来自大肠杆菌的转座子能在Mg²⁺存在下同时完成DNA剪切与接头“粘贴”：

该技术将建库时间从6-8小时缩短至1.5小时，催生了ATAC-seq等明星技术。但早期版本存在明显的序列偏好性和假阳性嵌合体问题。

2020年代，罗氏诊断的KAPA EvoPlus系列通过三大创新解决行业痛点：

EDTA耐受性：在2mM EDTA存在下仍稳定工作；

假阳性控制：将嵌合体错误率降至物理打断法水平；

室温稳定性：试剂在室温下保持活性达5周以上。

这些改进使酶切法真正适用于临床样本检测，特别是对EDTA抗凝剂敏感的血液样本。

2024年，酶切法迎来与自动化工作站深度融合的新阶段：

板式预封装试剂：国内公司推出96孔板预装试剂盒，开盖即用；

声波移液技术：Biomek+Echo系统实现纳升级精准移液；

无人值守建库：单次处理384样本仅需4小时。

巅峰对决：酶切法vs传统方法

根据罗氏诊断最新测试数据（2024年7月），第三代酶切技术在关键指标上已比肩甚至超越传统方法。在微量样本（如液体活检）和困难样本（如FFPE组织）中，酶切法展现出显著优势。罗氏数据显示，使用1ng cfDNA建库时，酶切法能提高低丰度突变检出灵敏度3倍以上。

随着2024年板式预封装试剂盒的普及，实验室迎来“即拆即用”时代。国内公司将整个建库流程所需试剂预分装在96孔板中，配合自动化工作站实现：

零手工移液：避免人为误差；

统一质控标准：孔间差异CV值<5%；

超均一覆盖度：GC偏好性接近机械打断法。

从2010年转座酶的首次应用到2024年全自动板式解决方案，酶切法建库走过了从“能用”到“好用”的进化之路。随着中国企业在该领域的持续创新，曾经困扰行业的二聚体、GC偏好性、自动化兼容等问题正被逐一攻克。

未来，当我们在超高通量测序平台上轻松处理成千上万的样本时，不要忘记这群在微观世界里操控“分子剪刀”的工程师们——正是他们让基因解码变得如此高效而精准。