2×Seamless Cloning Premix 是我公司开发的一款简单、快速、高效的通用型无缝克隆产品，可将插入片段快速定向克隆至任意载体的任意位点，在保证克隆数多和阳性率高的同时，一次可实现多至5个插入片段的同源重组。2×Seamless Cloning Premix 可应用于快速克隆、高通量克隆、无缝克隆和DNA定点突变等领域。
无缝克隆可将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点，在目的片段两端引入同源臂，使片段和线性化载体的末端序列保持一致，在重组酶的作用下，50℃孵育15-60 min即可完成重组反应。从而达到“无缝”的效果。
图1：无缝克隆原理
与传统酶切连接比较，单次酶切连接只能连接一个片段，而无缝克隆单次反应能完成一个至多个片段的克隆。
无缝克隆与酶切连接相比，没有酶切处理的过程，插入片段和线性载体可通过PCR扩增(或酶切)进行制备，并且只需要将重组体系在50 ℃处理15-60min，即可进行转化。
无缝克隆不受限于限制性内切酶位点，可以在载体的任何位置插入目的片段。
无缝克隆与酶切连接相比，没有酶切处理的过程，实验周期更短。
酶切连接为了提高连接效率，通常需要连接处理1h甚至更久，无缝克隆只需要将重组体系在50 ℃处理15-60 min，即可进行转化。
根据实验目的，无缝克隆可以进行快速克隆、高通量克隆、无缝克隆、DNA定点突变和长转录本克隆等。
2×Seamless Cloning Premix无缝克隆试剂盒可一次实现多至5个插入片段的无缝克隆，克隆数量多，阳性率高(>95%)。
A：载体与单片段重组克隆验证；
B：载体与3片段重组克隆验证；
C：载体与4片段重组克隆验证；
D：载体与5片段重组克隆验证。
引物设计不正确：引物应包含15-25 bp同源臂，GC含量在40-60%之间。
组装体系比例不合适：按照说明书推荐用量进行配置，线性载体和片段加入过多或过少均会对重组效果有影响。
线性载体和片段不纯：核酸纯度过低会影响重组效果，可提高线性载体和片段浓度。
感受态细胞转化效率低：感受态细胞转化效率应大于10⁷cfu/μg。
PCR产物含有非特异性扩增产物：优化PCR扩增体系，提高特异性；胶回收PCR扩增产物，回收单一片段；对更多转化子进行鉴定。
扩增模板处理不彻底：转化时设置阴性对照，验证酶切或扩增产物是否线性化完全；优化酶切体系，增加酶切酶用量或酶切时间。
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