一文告诉你单克隆抗体的制备、纯化的点点滴滴

1. 概念

定义：抗体是一种由免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）构成的Y形蛋白质，能够特异性识别并结合抗原、激活补体系统、介导免疫细胞清除病原体。由两条重链和两条轻链构成， Ig重链的分子量约为50~75kDa，由450~550个氨基酸残基组成。Ig轻链的分子量约为25kDa。根据重链的不同，Ig可分为五个类（class）：IgM（μ）、IgD（δ）、IgG（γ）、IgA（α）和IgE（ε）。还可以分成亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2a和IgG3等。根据轻链的不同，Ig可分为κ型和λ型（可用商业化抗体型检测试剂鉴别）。

2. 结构

图1：单抗结构及功能

3. 功能

表1：不同类别抗体的功能

1. 抗原的种类与制备：

抗原的种类与制备方法

多肽抗原：多肽可以有效地提高抗体对抗原某区域的特异性，当重组蛋白难以表达或纯化，而且没有其他来源的抗原时，可以选择商业公司提供的多肽合成定制服务。多肽免疫原使用受限是因为其线性表位序列短，由多肽产生的抗体趋向于识别线性表位，通常不能识别蛋白质构象，因而不太可能和天然分子反应。多肽抗原由于长度较短被视为半抗原，需要结合载体蛋白（如牛血清白蛋白和卵白蛋白）以提高其免疫原性。对于小于3kDa的多肽来说，这种结合被认为是有必要的，对于任何不超过10kDa的多肽来说，这种结合可能是有益的

全细胞免疫：对于通常表达在细胞表面的天然抗原，用全细胞抗原来制备抗体是很好的选择，就在细胞系中外源表达的膜蛋白而言，如果该细胞系来源于用于生产该抗体的物种（如果是小鼠，应是同一品系），那么重组细胞中除了表达的重组抗原外，其他成分应该都无免疫原性。该细胞系能够对重组抗原进行翻译后修饰，使其像天然蛋白质一样，并将抗原的相关构象表位呈递于细胞表面。

基因免疫：当重组蛋白不能被表达的情况下，可以利用接种基因疫苗进行制备抗体，主要包括以下三种：①质粒DNA：可以选择商业化的带有强启动子的哺乳动物表达质粒，如pVAX1和pCI质粒等，通过基因枪或注射器免疫小鼠，需要注意的是，该方法引体的抗体效价可能较低；②腺病毒/腺相关病毒/慢病毒等：病毒类载体在体内的蛋白质表达量更高，所以诱导的抗体效价也更高，常用的有如AdEasy系统等；③ mRNA疫苗：通过体外制备mRNA，并用LNP等递送系统包裹进行小鼠免疫，产生的抗体效价也很高（笔者就曾试过该方法，对mRNA疫苗研究较有经验）。

2. 佐剂：在制备单克隆抗体，用蛋白质抗原进行免疫动物时，为了得到较高的抗体效价，需要配合佐剂。常用的佐剂有弗氏佐剂（油包水佐剂），铝佐剂（氢氧化铝）等。近年来，也出现了水佐剂等新型佐剂。根据是否含有卡介苗，弗氏佐剂分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂（不含卡介苗），弗氏完全佐剂仅用于初次免疫，再次免疫会在注射局部产生严重损害，弗氏佐剂的制备方法如下：

使用注射器乳化：

 弗氏完全佐剂（或弗氏不完全佐剂）能用两个注射器在无菌条件下进行乳化，随后只需要加上注射器针头便可进行注射。

材料：弗氏完全佐剂（油包水型，石蜡油、羊毛脂、卡介苗）或弗氏不完全佐剂（油包水型,，石蜡油，羊毛脂）、防护眼镜、两个转用的同一型号带Luer-lock的注射器（3,5,10ml）、带Luer-lock的双孔乳化接头、抗原（溶于水或其他适当的稀释液中）、手套、烧杯（盛有预冷的自来水）。

实验步骤：

①计算每次 所需抗原的量和体积，皮下注射或肌肉注射时，每只小鼠每次5~100μg抗原，注射体积小于200μl；腹腔注射时，每只小鼠每次注射体积为200~500μl。强洗涤剂会减弱乳化效应。准备大约比最终所需量多50%的抗原。

②根据所加材料的总体积选择针筒。佐剂和抗原的总体积应大约为针筒体积的一半。例如，准备2.5ml的疫苗时，用5ml的针筒进行乳化。

③ 使用前37℃预热弗氏完全佐剂（或弗氏不完全佐剂），振荡1～2min或用手倒转瓶子数次，将结核分枝杆菌均匀重悬。吸取所需体积的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂到针筒内，连接针筒到双孔接头，排出空气（过量空气将妨碍稳定的乳化剂的形成）。

④吸取水溶性抗原到另一针筒，排出空气（过量空气可妨碍稳定的乳化剂的形成）。

⑤将有抗原的针筒连在双孔接头的一端。确定两个针筒均经Luer-lock安全地固定在双孔乳化接头上。

⑥平稳地推动活塞，使所有的抗原溶液穿过双孔接头与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合。相互交替，持续使混合物从一个针筒转到另一个

⑦按上述步骤继续乳化，直至稳定的乳化剂形成，这将需要数分钟，推出一小滴乳化剂到盛有水的烧杯内，小乳滴应该在水面形成稳定的油珠。如果乳剂滴入水面分散，则需要重组组装针筒，继续乳化。

图2：注射器乳化示意图。

A. 将注射器确定地经Luer-lock连接到双孔接头。

B. 首先将水溶性抗原溶液推入油液中，气候把混合液推过接头，交替进行。

C. 稳定的乳化剂形成后，移去接头后换上注射针头，或将乳化剂转入一个1ml注射器以备使用。

3. 使用超声乳化

材料：弗氏完全佐剂（油包水型，石蜡油、羊毛脂、卡介苗）或弗氏不完全佐剂（油包水型,，石蜡油，羊毛脂）、无菌聚丙烯管、防护眼镜、注射器、抗原（溶于水或或PBS）、超声探头、手套、烧杯（冰浴）。

实验步骤：

 ① 计算每次注射所需抗原量及体积。皮下注射或肌肉注射时，每只小鼠每次5～100μg，少于200μl。腹腔内注射时，每只小鼠每次200～500μl。洗涤剂会减弱乳化作用，应避免。准备大约比所需量多50％的疫苗。

 ② 使用前37℃预热弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，强烈振荡1～2min，或用手倒转瓶子数次将结核分枝杆菌均匀重悬。将弗氏完全佐剂与等体积的水溶性抗原转入一无菌聚丙烯管中。

 ③ 超声处理可产生大量热，会导致蛋白质抗原变性。为避免混合物过热，在超声中或间隙将聚丙烯管置于冰上。每次间歇5～20s，上下调节管的高度，确保整个混合物均匀乳化。注意操作时佩戴耳塞。

 ④ 倒转聚丙烯管以确定乳化剂的稠度。持续乳化，间歇10s，直到稳定的乳化剂形成。当乳化剂在倒转的管中不动或在水面上形成稳定的油珠时，乳化即可完成

 ⑤ 将乳化剂吸入1ml注射器，或者用Spack和Toaves的转移技术将乳化剂转入1ml注射器内，具体步骤如下：从一个注射器上取出无菌推芯，芯头的大小与乳化剂所在的管内直径一致。乙醇擦拭管底以灭菌，然后用灭菌的18号针头在管底穿孔，握住一个已拔出推芯的1ml无菌注射器顶部直接对准乳化剂管底的洞，用上述大小合适的无菌推芯将管内乳化剂从管底推入1ml注射器

4. 免疫策略：

典型的免疫策略依赖于抗原的反复刺激，以增强特异性免疫应答并使其成熟。常用的免疫策略是如图所示，如果佐剂使用弗氏佐剂，则初次免疫使用弗氏完全佐剂（含有卡介苗），之后的加强免疫时应使用弗氏不完全佐剂佐剂。当两次加强免疫结束后，利用ELISA/流式细胞术/免疫共沉淀/中和实验测定抗体效价（根据制备的单抗的特性不同选择不同的方式），判断是否需要进行第三次加强免疫或直接进行冲击免疫。融合前冲击免疫最有效的途径是静脉注射，如果抗原不适合静脉注射（如抗原是颗粒状的，或含有的缓冲液成分可能有毒），可以采用不含佐剂的抗原腹腔内注射进行冲击免疫。

表2：动物免疫时间流程

5. 多肽抗原免疫策略

1）小鼠：BALB/c，雌性，6～8周龄。

初次免疫：取50μg多肽加10μg弗氏完全佐剂，加磷酸盐缓冲液（PBS）至液体总量200μl，腹腔注射；

加强免疫（至少两次）：取50μg多肽加10μg弗氏不完全佐剂，加PBS至总量200μl，每3～4周腹腔注射一次；

最后一次免疫：腹腔注射100μg多肽（不加佐剂，如果液体量小且足够的话可以静脉注射），3～4天后取脾。

2）家兔：新西兰白兔，雌性，8周龄

初次免疫：取0.4mg多肽加0.1mg胞壁酰二肽（muramyl dipeptide，MDP）佐剂，加PBS至液体体积1ml，再加等量弗氏完全佐剂混匀乳化后，皮下注射（4个部位：两侧腹股沟和腋窝）；

4周后第一次加强免疫：取0.2mg多肽，加PBS至液体总量1ml，再加等量弗氏不完全佐剂混匀乳化后，皮下注射（4个部位：两侧腹股沟和腋窝）；

第二次及随后的加强免疫：取0.1mg多肽加50～100μl PBS，无佐剂，静脉注射，4周一次；最后一次加强免疫后5～7天取血，可得到20ml血清。

由多肽产生的抗体应在预先免疫后的加强免疫期间收集血清进行检测。使用没有载体结合的多肽包被反应板做酶联免疫吸附实验，以区分是多肽还是载体引起的免疫应答。因此，一定只把部分多肽和载体结合，而留一些多肽用于以上实验。

6. 蛋白质抗原免疫策略

1）小鼠：BALB/c，雌性，6～8周龄。

初次免疫：取25~50μg蛋白质加10μg弗氏完全佐剂，加磷酸盐缓冲液（PBS）至液体总量200μl，腹腔注射；

加强免疫（至少两次）：取等量蛋白质加10μg弗氏不完全佐剂或其他佐剂（如博鳌龙的腹水制备佐剂），加PBS至总量200μl，间隔3～4周进行腹腔注射；

最后一次加强免疫后，3～4d取脾。

2）家兔：新西兰白兔，雌性，8周龄

初次免疫：取0.4mg蛋白质加0.1mg胞壁酰二肽（muramyl dipeptide，MDP）佐剂，加PBS至液体体积1ml，再加等量弗氏完全佐剂混匀乳化后，皮下注射（4个部位：两侧腹股沟和腋窝）；

4周后第一次加强免疫，取0.2mg蛋白质，加PBS至液体总量1ml，再加等量弗氏不完全佐剂混匀乳化后，皮下注射（4个部位：两侧腹股沟和腋窝）；

第二次及随后的加强免疫：取0.1mg多肽加50～100μl PBS，无佐剂，静脉注射，4周一次；最后一次加强免疫后5～7天取血，可得到20ml血清。

7. 全细胞抗原免疫策略

小鼠：BALB/c，雌性，6～8周龄。完整细胞通常具有强免疫原性，无需佐剂辅助。将细胞用 PBS 洗涤三次后，以适当的浓度悬浮于 PBS。免疫小鼠的典型剂量为

2×106∼50×106个细胞，腹腔注射（0.4ml，108个细胞/ml），此外，也可使用静脉注射，剂量为 0.1ml（浓度为 108个细胞/ml）。

间隔 3～8 周用类似的剂量进行加强免疫。

最后一次免疫后 2～4 d取脾。

8. 基因免疫策略

质粒表达载体的免疫接种：

免疫接种质粒表达载体的方法较多。对小鼠和家兔的标准免疫进度如下。

1）小鼠：BALB / c，雌性，6～8 周龄。

剂量：每次 100μg。

免疫途径和用量：一种方法是在小鼠每个后腿胫骨前（胫）肌肉进行肌肉注射 50μl（用结核菌素注射器和 28 号针头），总量为 100μl。另外一种方法是在小鼠尾巴底部皮内注射 100μl。皮下注射 DNA 无效。

方案：免疫 4 次，每次间隔不少于 10d，每 3 周一次最佳。每次免疫接种前需监测血清抗体的效价。最后一次免疫接种后 3～4d 取脾以制备杂交瘤细胞。

2）家兔：新西兰白兔，雌性，8 周龄。

剂量：1mg/次。

免疫途径和用量：在家兔每个后腿胫四头肌肌肉注射 200μl 或在背部剪去被毛的多个部位皮内注射，每个部位 100μl，直至达到总量为止。

方案：免疫接种至少 4 次，必要时可以更多，每月一次。每次接种后 3 周取血来监测血清抗体的效价。

腺病毒的免疫接种由于没有E1基因,这些重组腺病毒不能在免疫接种的动物体内进行复制,也不会产生子代颗粒。然而,无论是实验室还是动物室使用的材料,都应在Ⅱ级生物安全标准(BL-2)的条件下处理。每批腺病毒的定量可以用“总颗粒数/ml”表示(但是不一定能全部计数),或者用“感染性单位(空斑形成单位，pfu)/ml”表示。如果用于免疫接种,使用“空斑形成单位/ml”(pfu/ml)来定量更合适。

1）小鼠：BALB / c，雌性，6～8 周龄。

    剂量:最佳剂量将随着特异性抗原不同而不同，但给每只小鼠接106~108pfu(以适宜的浓度溶于PBS)来测试免疫反应是合理的。在接种前,解冻的腺病毒应冰浴保存。

    免疫途径和用量:在小鼠每个后腿胫骨前肌肌肉注射50μl(用结核菌素和28号针头)，总量为100μl。另外一种方法是在小鼠尾巴底部皮内注射100μl。用腺病毒免疫接种时，和皮下注射相比，肌肉注射和皮内注射可以引起更强有力的抗体应答。

    方案：免疫2次，间隔3周。因为动物体内诱导了病毒中和抗体，进一步的免疫接种将不会增强反应强度。最后一次免疫接种后3~4d取脾来制备杂交瘤细胞。

2）家兔：新西兰白兔，雌性，8周龄。

     剂量：107~109pfu，用PBS稀释至适当浓度。在接种前，解冻的腺病毒应冰浴保存。

     免疫途径和用量：在家兔每个后腿胫四头肌肌肉注射200μl或在皮肤剪去被毛的多个部位皮内注射，每个部位100μl,直至达到总量为止。

     方案：免疫2次，间隔3周。因为动物体内诱导了病毒中和抗体，进一步的免疫接种将不会增强反应强度。

3. mRNA疫苗的免疫接种：

 小鼠：BALB/c小鼠，雌性6~8周龄。

u 剂量：根据所制备的mRNA疫苗的免疫原性确定最佳剂量（一般是1-10μg），笔者曾用10μg的mRNA-LNP免疫小鼠，肌肉注射，免疫两针，抗体效价较高。之后用蛋白质抗原进行了第三针加强免疫，取得了非常好的抗体效价，并成功制备了单克隆抗体（未在兔子上进行过实验）。用该方法制备单克隆抗体的实验指南是笔者通过自己的实验尝试总结出来的，仅作为参考，如想讨论技术细节，可加笔者微信讨论。

2.3 杂交瘤细胞融合

2.3.1 骨髓瘤细胞的培养

每次细胞融合前复苏一管新的骨髓瘤细胞，细胞在融合前的培养时间应该不超过两周，要始终保持在对数生长期，密度不超过10⁵个细胞/ml。骨髓瘤细胞通常用含10% FBS的RPMI 1640完全培养基培养，每周传代2~3次，使其密度为12.5  X 10⁴~ 1 X 10⁵个细胞/ml。同时，应取一些骨髓瘤细胞培养在含HAT的选择培养基中，以确定是否所有的细胞都会死亡、是否骨髓瘤细胞被污染、选择试剂是否有效等。在与脾细胞进行融合前，用无血清的RPMI 1640清洗骨髓瘤三次，去除培养基中的蛋白质，并无无血清的培养基重悬骨髓瘤细胞，使其浓度为1 X 10⁷个细胞/ml，骨髓瘤细胞的活率应大于95%。

2.3.2 脾脏B淋巴细胞的准备：

① 当测定的血清效价有意义（＞1:1000，在实际情况下血清效价越高越好，根据经验，当效价超过1:10000时，更合理）的免疫后动物可以提供取脾制备B细胞，进行融合。动物用吸入CO2或者脱颈处死，用75%的酒精浸泡消毒5分钟，并在无菌操作下取组织，用灭菌的剪刀处理小鼠并取出脾脏，放入无菌培养皿中，剪去脾脏表面粘附的脂肪及结缔组织，并用RPMI 1640基础培养基清洗脾脏。

②  将清洗干净的脾脏放入无菌滤网（200目）中，并用剪刀将脾脏剪碎，用注射器橡胶活塞轻轻研磨脾脏，加入5 mL RPMI 1640基础培养基重悬研磨后的脾细胞，将细胞悬液吸入50 mL灭菌离心管中，离心（4℃，1200 rpm，10 min），弃上清，重复洗涤脾细胞三次。用适量的RPMI 1640基础培养基重悬细胞，检测细胞密度与活率，将细胞密度调整至10⁷个/mL，备用。

2.3.3  饲养层细胞的制备

① 细胞融合前一天，取5只未免疫的BALB/c雌性小鼠，颈椎处死，75％酒精浸泡消毒5 min。在无菌环境及操作下，用解刨剪刀剪开小鼠腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器吸取5 mL RPMI 1640基础培养基，将针头小心刺入腹膜内（切勿刺破肠管），来回抽吸液体冲洗小鼠腹腔。

② 将腹腔冲洗液转入50 mL无菌离心管，继续加基础培养基至25 mL，离心（1200 rpm×10 min），弃上清，重复操作一次，加入适量的20％ FBS HAT选择培养基重悬细胞。

③ 每孔100 mL加入10块96孔细胞培养板中，放入37 ℃、5％CO2细胞培养箱内备用。

2.3.4 杂交瘤细胞融合与筛选（细胞融合前，所有材料和设备都应该准备好，培养基组分要预热到合适的温度）       

（图3：杂交瘤细胞融合流程）

备注：脾细胞与骨髓瘤细胞的比例通常为2 : 1~10 : 1；

 培养基可用DMEM或者RIPA-1640；

 融合2~3d后用20％ FBS HAT选择培养液进行半量换液，融合后第四天开始于倒置显微镜下观察细胞融合情况，并对有杂交瘤细胞克隆的培养孔做好标记。若融合效率过低，则需要重新融合。待96孔细胞培养板中的杂交瘤细胞克隆至整孔视野的1/4以上时，即可进行阳性杂交瘤细胞的筛选。

2.4 杂交瘤细胞的筛选与单克隆化

利用ELISA/流式等筛选克隆成功的阳性杂交瘤细胞（笔者只做过ELISA有限稀释法筛选过阳性克隆）

2.4.1阳性杂交瘤细胞的正向筛选

①细胞融合后的初筛检测所有的细胞板，初筛得到的阳性孔进行后续试验。

②待细胞培养至细胞孔底部可以看到1/4以上面积的杂交瘤细胞集落时，取细胞上清，用间接ELISA方法检测，以阴性血清为未免疫小鼠血清，免疫小鼠眼球血为阳性血清。

2.4.2 阳性杂交瘤细胞的反向筛选

 如需对血清的特异性需要进一步检测，可以反向筛选检测，即以不含目的抗原的其他成分铺板检测血清是否是阴性。

2.4.3 有限稀释法克隆化杂交瘤细胞：为了筛选到单个的杂交瘤细胞，可以用有限稀释法进行操作（也可用流式细胞进行分选）。

①  杂交瘤细胞克隆化的前一天，准备饲养层细胞，放入细胞培养箱内备用（T=37℃，5% CO₂）。

② 利用间接ELISA筛选出阳性孔细胞，并在无菌操作环境下轻轻吹打混匀，进行细胞计数。根据细胞数进行连续稀释，调整至3~10个细胞/ml，将10ml/板的稀释后的细胞按照100μl/孔加至预先准备铺有饲养层细胞的96孔板中进行培养（T=37℃，5% CO₂）。一周后，对孔中仅有一个细胞集落的单克隆杂交瘤细胞上清进行ELISA检测，按上述步骤继续进行有限稀释克隆3-4次，直至每块96孔细胞板中所有的单克隆细胞株培养上清的间接ELISA检测结果均为阳性，克隆化终止。

③将筛选出的阳性单克隆杂交瘤细胞转移至24孔板中培养，待细胞长满后转移至T25细胞瓶中扩大培养，之后传至T75瓶进行扩大培养，在整个过程中需要用ELISA检测杂交瘤细胞的传代稳定性。