限制性内切酶HinP1I，HhaI，AciI

细菌限制性修饰系统(Restriction-modification systems ，R-M)作为原核免疫系统攻击进入细胞的外源DNA，限制性修饰系统包含执行两种功能的酶：限制性内切酶（REase）：负责结合特定的DNA序列(识别位点)，如果序列未甲基化，会将其识别位点的DNA序列进行切割；DNA甲基转移酶（MTase）：负责识别相同DNA序列，并催化甲基转移到识别序列中的特定碱基上，从而保护其不被REase切割。

编码特定限制性内切酶的细菌基因及其同源甲基化酶在细菌染色体上彼此相邻，但不一定在同一方向上。紧密的物理连接减少了两个基因在细菌结合过程中因重组而分离的机会。

图1 细菌限制性修饰系统的防御功能

限制性核酸内切酶是分子生物学的主要内容，作为位点特异性DNA识别、切割机制、体内功能和进化起源的模型。

根据限制性内切酶的结构域、辅因子、识别序列的长度和对称性以及酶切位点，将限制性内切酶分为I型、II型、III型和IV型。从克隆的角度来看，最重要的限制性内切酶属于II型，数以百计的商业化II型限制性内切酶用于分子克隆。

表1 限制性内切酶分类

将限制性内切酶分类为II型限制性内切酶的主要标准是能在识别位点内部或外部(通常在20bp内)的固定位置上特异性切割两条DNA链，并且不需要ATP水解提供能量，根据各自亚型的特性将II型限制性内切酶分类，分类标准如下： 

01  识别序列的对称性，如II A型与II P型。

02  DNA切割的位置，在识别位点上或远离识别位点如II P型、II S型，如果切割的位置远离识别位点，切割在位点的一侧还是两侧如II S与II B型。

03  II型限制性内切酶与其同源甲基转移酶是否以独立的形式存在，如II C型在一个多肽中同时具有两种活性。

04  是否需要辅因子镁离子和s -腺苷甲硫氨酸。

由于这些分类标准之间并不相互排斥，因此一个II型限制性内切酶可以同时属于多个子类型如，Bcg I既属于II A型又属于II B型

II 型限制性内切酶的活性位点已在许多不同的金属结合态的晶体学上观察到。

II 型限制性内切酶的催化结构域有一个共同的结构核心，由两侧的α-螺旋和中央四股混合β-折叠组成αβββαβ拓扑结构。

核心作为保守活性位点的支架，通常由两个或三个酸性残基(天冬氨酸或谷氨酸) 和一个赖氨酸残基组成，共同形成PD-(D/E) XK基序 (X是任何氨基酸，见图2) ，活性位点位于第二和第三核心β折叠的Y形弯曲中，该Y形弯曲将催化残基(天冬氨酸，谷氨酸和赖氨酸) 从相对保守的PD-(D/E) XK基序中暴露出来，这些残基起着催化作用，包括多达三种二价金属离子辅助因子的配位，第四个核心β折叠往往具有很强的疏水性，它深深地埋在结构的疏水核心内。这种α/β/α三明治折叠能够容纳许多修饰。

图2 PD-(D/E) XK基序

不同酶量下切割1µg 质粒效率验证：取竞品和宝锐10U/µl AciI内切酶做梯度稀释：分别稀释成10U/µl，5U/µl，2.5U/µl，1.25U/µl，0.625U/µl，37℃反应1h后做电泳验证。反应体系如下：

固定10U AciI酶量下，切割质粒效率验证：取竞品和宝锐10U/µl AciI内切酶1µl，酶切1µg，2µg，5µg，10µg 质粒，37℃反应1h后做电泳验证。

反应体系如下：

II 型限制性内切酶在不同细菌物种中的普遍性和多样性被认为是由于进化中对噬菌体基因组和其他入侵DNA的强大防御机制的共同需要，由于它们能够在精确的位置切割DNA分子，II型限制性内切酶被广泛用作重组DNA技术的工具。

未来随着重组DNA技术、DNA诊断学、DNA鉴证学等新技术不断发展，限制性内切酶将会得到更为广泛的应用。

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参考文献：

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