mRNA技术的应用领域主要分为：免疫疗法、蛋白质替代疗法、基因编辑以及再生医学疗法，其中免疫疗法中的肿瘤免疫和预防性疫苗是目前的研究热点，也是技术最为成熟的领域。
根据新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则（试行）关于载体的相关规定如下：
//模板设计、转录模板质粒构建和菌种库研究资料//
1. 目的抗原选择依据及来源
1.1
明确目的抗原来源、氨基酸和基因序列及蛋白结构，与当前流行株的核苷酸和氨基酸同源性进行分析。
1.2
明确目的抗原选择的依据以及其表达蛋白在预防新型冠状病毒中的作用或作用机理。
1.3
提供目的产物的理论序列、分子量、分子式、二硫键（如有）、修饰（如有）等重要结构信息。
2. DNA转录模板序列设计及结构
2.1
对DNA转录模板设计进行全面阐述，除目的抗原涉及的mRNA序列外，需重点提供其功能性元件的设计及确认研究结果，如，帽子结构设计，转录启动子的选择，5’UTR和3’UTR的设计，信号肽的设计，Poly(A)加尾结构/长度设计、所用核苷三磷酸（NTP）类型及其修饰信息等。
2.2
若对编码目标抗原的mRNA序列进行了任何修饰、序列改构或序列优化（如密码子优化等），均应详细提供修饰或序列更改的依据与目的（如提高mRNA翻译效率、降低先天免疫原性、增加稳定性等）。应提供结构示意图等，并对基因修饰或序列改构的利弊进行权衡分析，提供确认的支持性研究结果。如可能，应评估构建的mRNA疫苗本身的免疫原性。
2.3
某些情况下，若构建的基因序列包括除抗原目的基因以外的其它基因序列时，应对额外引入基因序列的作用和选择依据进行分析，如具有利于S蛋白三聚体形成的额外插入序列等，并提供相应序列设计及确认研究数据结果。
1
应对转录模板的控制元件和选择标记的序列与来源进行阐述，如：转录启动子、转录终止序列、抗生素抗性标记等进行分析。抗生素使用应符合《中国药典》的相关要求。
2
应提供构建和制备转录模板质粒的详细信息和步骤、鉴定及确证方法。
3
对转录模板质粒应结合工程菌种子库的检定进行全基因序列分析及确认，提供用于生产mRNA的转录模板的全长核苷酸序列，尤其对转录模板的控制元件、插入的目的基因序列、选择标记基因有无变异等进行分析。
工程菌应按《中华人民共和国药典》相关规定或与国际通行要求建立种子库系统，并提供国家药品检定机构相应检定报告。
1
明确宿主菌的来源、基因型、表型以及目标克隆筛选的流程。鼓励对宿主菌开展鉴定研究，鉴定项目可包括：鉴别、抗生素敏感性等。
2
工程菌的建立及鉴定：经转化条件优化后，将合格的目标质粒转化至适宜的工程菌，经克隆筛选后建立种子库系统。
3
种子库的检定：应保证种子库无外源因子污染及目的基因序列和其他元件的准确性，包括细菌形态学、培养物纯度、质粒限制酶切图谱、目的基因和其他元件测序等。鼓励对工程菌活性、质粒保有率、鉴别、抗生素抗性等指标进行检定。
4
传代稳定性研究：开展种子库遗传稳定性分析（序列大小、序列准确性、质粒限制酶切图谱、质粒拷贝数）并明确各级种子库的限定传代代次及依据。说明各级种子库的制备规模、保存条件、扩增条件、允许的传代次数等信息。
应对模板进行鉴别、DNA模板浓度/含量、测序、纯度、线性效率（如适用）、杂质残留、微生物限度、内毒素等检测。鼓励申请人建立DNA转录模板体外转录活性的质控。转录模板中的杂质残留可能包括宿主菌DNA、宿主菌RNA、宿主蛋白残留等。
质粒模板制备过程：需对转录模板制备的关键工艺参数及其控制范围进行确认，并建立相应的过程控制检测标准。
1
质粒浓度：酶切前浓度，酶切后浓度。质粒线性化酶浓度：不同浓度的酶线性化工艺的差异。
2
孵育时间：酶切时间与酶种类，酶切时间与体系，酶切时间与模板类型之间的关系。
3
4
5
6
如需储存，应明确储存条件、储存方式并进行相关支持性研究。建议考虑以下质控项目：
鉴别：PCR鉴定、酶切鉴定、测序；
DNA模板浓度/含量：微量分光光度计、HPLC；
纯度：HPLC；
线性效率（如适用）：HPLC；
杂质残留：包括宿主菌DNA、宿主菌RNA、宿主蛋白残留等；
微生物限度：中国药典微生物限度检测办法及标准；
内毒素等检测：中国药典内毒素检测办法及标准。
下表为常用的种子库菌株的用途和特点：
1.菌液PCR鉴定
菌液PCR是一种快速、高通量筛选目的片段是否存在的方法，操作简单。根据琼脂糖凝胶电泳图判断阳性克隆。
其中PCR鉴定引物设计要注意的是：优选：T7启动子前-poly(A)尾后；必选：ATG-终止密码子。
2. 酶切鉴定
将阳性克隆的菌液进行扩大培养，提取质粒后进行质粒双酶切鉴定。重组载体构建成功的质粒双酶切会出现双条带。
3. 测序鉴定
最后通过测序进一步鉴定是否有目的基因序列，将测序结果和目的序列进行序列比对，若构建成功会有100%的比对率。但需要注意的是，测序范围要至少保证T7启动子之前，poly(A)尾之后。如果出现测序异常，则判断缺失-是否发生在序列内部，是否对密码子产生影响。突变-突变发生的位点是否会影响密码子的阅读。
研究表明，标准质粒DNA有三种基本结构：超螺旋(Supercoiled，简称SC)，线性(Linear)和开环(opencircular，简称OC)，这三种颗粒有各种聚合形态。超螺旋被认为是一种能够最有效地提高转染效率和目的基因表达的质粒形式。在基因治疗和mRNA疫苗研究中，对药用质粒的超螺旋含量有明确要求(FDA:>80%，NMPA:≥90%，SMPA:>85%)。
构建成功的重组质粒通过不断优化可得到超螺旋比例满足实验需要的质粒，进而得到我们要的线性化模板。其对应的质粒电泳图和HPLC图如下所示：
对应的超螺旋质粒纯度：62.75％
对应的超螺旋质粒纯度：77.06％
对应的超螺旋质粒纯度：83.82％
对应的超螺旋质粒纯度：84.33％
对应的超螺旋质粒纯度：88.05％
对应的超螺旋质粒纯度：94.55％
对应的超螺旋质粒纯度：94.31％
宝锐生物积极布局生物制药领域mRNA疫苗原料酶的开发，依托完善的研发平台和开发经验，秉承对产品一贯精益求精的态度，成功推出mRNA疫苗生产核心原料酶系列产品，该系列产品包括T7 RNA聚合酶、牛痘病毒加帽酶、二氧甲基转移酶、mRNA加尾酶、无机焦磷酸酶、RNA酶抑制剂等，为保障我国生物制药上游原料的供应做出贡献。
参考文献：
1. 苗鹤凡, 郭勇, 江新香，et al. mRNA疫苗研究进展及挑战[J]. 免疫学杂志, 2016, 32(05):446-449.
2. Schmid A . Considerations for Producing mRNA Vaccines for Clinical Trials[J]. Methods Mol Biol, 2017, 1499:237-251.
3. FDA. Guidance for Industry-Considerations for Plasmid DNA Vaccines for Infectious Disease Indications. CBER. November 2007.
4. FDA. Guidance for Industry-Liposome Drug Products Chemistry, Manufacturing, and Controls; Human Pharmacokinetics and Bioavailability; and Labeling Documentation. CDER. April 2018.
