Poly(A)尾，作为mRNA的3'端结构，由多个腺苷酸（A）残基组成，其长度和分布对于mRNA的功能至关重要。在众多科学研究和实验中，这一结构已经被广泛地了解和认识。该结构在基因表达的多个层面发挥着调节作用。

在体外转录mRNA时，Poly(A)尾巴可以通过两种方法添加：一种是在DNA模板中编码，另一种是在转录后单独酶促添加。PCR方法适合小规模生产，但成本高且有突变风险，限制了其大规模应用。质粒生产成本较低，突变风险小，但存在重组问题，尤其对于长Poly(A)序列。

有研究表明：模板编码的Poly(A)可以产生同质产物，但酶促后聚腺苷化的产品组成难以控制。减少RNA生产步骤可降低成本。此外，mRNA的酶聚腺苷化需在碱性条件下进行，然而mRNA对碱性水解敏感，从而会降低mRNA质量（尤其当转录本>3kb时）。使用线性质粒系统如pEVL或pJAZZ可以稳定克隆长Poly(A)序列，但存在限制。理想方案是拥有一个稳定且翻译效率高的质粒模板编码的Poly(A)尾部。

对Poly（A）尾的分割是否会对大肠杆菌中高拷贝质粒载体的重组产生影响进行了研究：为了生成Poly（A）尾的重组RNA转录本，构建将DNA序列克隆至目标基因下游的质粒载体。考虑到PABP至少需12个腺苷结合，但单个PABP与Poly(A)结合不足以支持翻译，足够长的片段如Poly(A)3 × 40_6和Poly(A)2 × 60_6可确保每个片段结合3个以上PABP拷贝，故设计了不同Poly（A）及间隔分离器的组成（图1）。

图1 ：

A120：120A；

3×40_6：40A+6 nt NsiI酶切位点+40A+6 nt NsiI酶切位点+40A+6 nt NsiI酶切位点；2×60_6：60A+6 nt NsiI酶切位点+60A；

2×60_12：60A+12 nt NsiI酶切位点+60A；

2×60_24：60A+24 nt NsiI酶切位点+60A；

2×60_C：60A + C + 60A；

2×60_G：60A +G + 60A；

2×60_T：60A + T+ 60A；

ACH：63A+6 nt NsiI酶切位点+31 PolyC+17 Hairpin；

1×60_HP1：60A+38 Hairpin；

1×60_HP2：60 A+65 Hairpin.

相比于连续的Poly（A）,分隔开的Poly（A）能大幅度减少质粒重组率。

将不同蛋白编码区克隆到含不同Poly(A)序列的pUC57-卡那霉素载体中，转化到大肠杆菌后进行筛选。结果显示如图2，Poly(A)120格式的重组率超过50%，将Poly(A)拆分为Poly(A)3 × 40或Poly(A)2 × 60可减少重组，其中Poly(A)2 × 60_6的质粒重组率最低。

图2：量化A120的聚(A)尾重组和聚(A)3 × 40_6和聚(A)2 × 60_6的分段聚(A)尾。

Poly（A）分隔开后，相比于分隔前，翻译效率并不会发生明显的改变。

不同Poly（A）尾对mRNA稳定性和表达会有影响，结果如图所示，在不同时间点，分段聚(A)构建体中的d2EGFP蛋白水平与对照相当。计算mRNA产量发现，分段聚(A)构建体在4-24h的产量更高（图3）。

类似地，荧光素酶编码mRNA的实验表明，分段聚(A)2 × 60_6结构在修饰独立的情况下显著提高了蛋白质水平（图4-A）。不同修饰、不同Poly（A）格式对mRNA数量没有差异，在modification1、2中分段Poly(A)2 × 60_6结构的生产效率更高（图4-C）。与含ACH（图1）建构体相比，具有Poly（A）尾的结构表达的荧光素酶量显著增加，进一步证实了ACH构建体翻译效率的降低。

图3：A549细胞转染后d2EGFP蛋白表达及不同含聚(A) d2EGFP mRNA的定量测定。

图4：A549细胞转染后24小时荧光素酶表达及不同多聚A荧光素酶mRNA定量测定。

与具有细胞内报告蛋白(d2EGFP和荧光素酶)的Poly(A)120相比，重组减少和mRNA产量相当/更高，故对具有额外生理靶标的Poly(A)2×60_6格式进行测试。将优化的hEPO序列克隆到puc57-卡那霉素载体上，并使用与上相同修饰组产生mRNA。在人HEK293细胞中进行转染实验，并通过ELISA测定蛋白浓度（图5）。

结果显示，在不同剂量、时间点或修饰下，两种Poly(A)格式之间没有显著差异。

图5：转染Poly(A)120-或Poly(A)2×60-containing EPO mRNA后24小时(A)、48小时(B)和72小时(C)，

通过ELISA检测HEK293细胞上清中分泌的人促红细胞生成素蛋白水平。

对Poly(A)2×60_6或Poly(A)120的CFTR mRNA构建体进行研究，将使用未修饰的CFTR mRNA在16HBE14o-细胞中转染，转染后24和48小时，通过western blot检测CFTR蛋白，发现使用分段Poly(A)2×60_6与常规Poly(A)120相比（图6），对蛋白产量无负面影响。    

 图6：western blot法测定16HBE14o-裂解物中CFTR蛋白的相对定量。

研究特定Poly(A)间隔长度，构建了两种新的荧光素酶结构，分别含有12和24 nt间隔。转染A549细胞后，发现两种Poly(A)格式的荧光素酶mRNA表达降低。修饰特异性效应可能由于间隔段区域影响PABP与Poly(A)结合。增加间隔长度至6 nt以上，无显著翻译或稳定性优势。

图7：A549细胞转染后24 h荧光素酶表达及不同多聚(A)荧光素酶mRNA定量测定。

无论是C/T/G中哪种作为间隔子，其翻译效率接近。

构建三种以C、T或G为间隔的Poly(A)序列，并在A549细胞中比较了它们的luciferase mRNA。结果显示，与标准Poly(A)120相比，所有分段Poly(A)构建体的荧光素酶表达均更高（图8），且除少数例外，mRNA水平相似（图9）。单核苷酸间隔的片段Poly(A)可能增强了翻译效率，并减少了重组率。研究推荐使用带有6或单核苷酸间隔的分段Poly(A)区域，因为它对蛋白表达和mRNA半衰期无负面影响，同时减少了质粒重组。

图8：A549细胞转染后24 h荧光素酶表达及不同多聚(A)荧光素酶mRNA定量测定。

图9：用单核苷酸间隔物定量分析分段Poly(A)尾重组率。(n)用特定Poly(A)格式测试的荧光素酶克隆总数。

参考文献：