分子诊断技术是现代医学检测中不可或缺的一部分，特别是在病原体检测、遗传病筛查以及癌症早期诊断等方面，核酸扩增技术发挥了关键作用。PCR是目前最广泛使用的分子诊断技术，但由于其依赖于复杂的温控设备和反应周期较长，限制了其在一些领域的应用。因此，等温扩增技术（如LAMP、NASBA等）逐渐成为替代方案，尤其在现场检测和快速诊断中表现出独特的优势。
在过去的5年里，LAMP反应是等温扩增中关注度最高，发展最快的一种技术，它已被用于快速诊断流感、结核病、寨卡病毒等。不过LAMP检测的开发存在一定难度，尤其是在引物设计和多重检测上，给许多研发人员带来了不小的挑战，那么有没有更简单、更容易开发的等温扩增呢？其实在LAMP技术出现之前，就已经有了，这就是本文重点要介绍的NASBA技术。
NASBA（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification，核酸序列基础扩增）技术作为一种等温核酸扩增技术，不依赖于传统的PCR技术中所需的温度循环，而是在恒定的温度下通过一系列的酶反应进行核酸扩增。该技术的关键优势是能够在不依赖高温的情况下，进行高效的核酸扩增，尤其适用于现场快速检测。
NASBA核心原理
NASBA技术是以RNA模板进行等温核酸扩增技术，先以单链RNA为模板，在42℃恒温条件下，通过逆转录酶、RNase H和T7 RNA聚合酶以及正向引物和反向引物来模拟体内逆转录病的的复制机制进行目标RNA的扩增。90分钟可以获得10-12 倍产物，灵敏度最高达单个拷贝；相对于免疫学方法或其他核酸检测方法，NASBA技术特异性强、检测快速，由于反应产物是单链RNA，因而可采用杂交检测系统来提高该技术的敏感性和特异性。
反应组分：
模板RNA
引物对：两种特异性引物：
第一引物（P1）：在5’端携带T7 RNA聚合酶启动子序列。
第二引物（P2）：互补于目标RNA的下游序列。
三种酶：
AMV逆转录酶:用于合成cDNA
RNase H：降解RNA:DNA杂交链中的RNA
T7 RNA聚合酶：从双链DNA模板中转录生成RNA扩增产物
核苷酸（dNTPs 和 NTPs）
缓冲液：优化酶活性
反应步骤-NASBA反应分为以下几个阶段：
1. 初始变性：63-65℃进行20分钟，对RNA二级结构进行解旋
2. 逆转录
目标RNA和引物结合：模板RNA与含有T7启动子序列的第一引物P1结合
合成第一链cDNA：AMV利用RNA模板，从P1引物开始，合成与RNA互补的单链cDNA
3. RNA降解
RNase H作用：RNase H特异性降解RNA:DNA杂交分子中的RNA链，留下单链cDNA
4. 第二链cDNA合成
第二引物P2结合：P2引物结合到单链cDNA的互补区域
延伸：AMV逆转录酶从P2引物开始合成第二条DNA链，形成双链DNA
5. RNA扩增
T7 RNA聚合酶起作用：T7 RNA聚合酶识别双链DNA模板中的T7启动子序列，并以此为模板转录生成大量RNA分子
循环扩增：新生成的RNA分子可作为模板，重新进入上述循环，进一步扩增产物，从2-5开始进入扩增循环，在41°C下进行。
反应特点：
直接对RNA进行扩增
等温：反应在恒定温度（通常为41°C）下进行，无需热循环设备。
*虽然NASBA有初始变性的步骤，但是由于不需要像PCR一样在高低温中循环，所以仍然被认为是一种等温扩增反应。
高特异性：T7 RNA聚合酶特异性识别T7启动子，并且双引物设计确保扩增的特异性
线性RNA产物：与PCR生成的指数扩增不同，NASBA生成线性扩增的RNA产物。
NASBA产物检测
虽然NASBA扩增产物为RNA，与LAMP的DNA扩增产物不同，但是NASBA产物检测方法与LAMP几乎一致，具体包括：
1. 荧光探针法：荧光探针（如Taqman探针）在扩增过程中与目标RNA序列结合，只有在探针与目标RNA序列结合并被T7 RNA聚合酶降解时，荧光信号才会被释放出来，实时监测产物的增加。
2. 凝胶电泳法：将扩增产物通过凝胶电泳分离，利用不同分子大小的差异来判断是否成功扩增了目标序列。凝胶电泳可使用DNA/RNA染料（如EB染料或SYBR Green）进行可视化。
3. 比色法：利用与扩增产物反应的颜色变化来进行检测。例如，使用带有酶标签的探针或染料，当扩增反应完成后，加入底物产生颜色反应。颜色的变化代表RNA的存在和数量，适用于POC平
4. 荧光染料法：嵌合型的荧光染料（如SYBR Green）能与双链RNA结合，并在激发后发出荧光信号。通过实时检测荧光信号的强度变化，可以实现对扩增产物的定量分析。
5. 电化学法：通过检测扩增产物对电化学信号的影响来实现定量分析。电化学传感器能够感应到反应过程中的离子变化、电流或电位变化，从而推测出目标RNA的浓度。
6.侧向层析法：通过胶体金或荧光法捕捉RNA产物在试纸条上显色
不同的检测技术各有优势，选择合适的检测方法取决于实验的需求。例如，荧光探针检测常用于高灵敏度的实时监测，凝胶电泳适用于基础研究阶段的产物验证，比色法和荧光染料染色则多用于现场快速检测。通过结合这些技术，NASBA扩增可以实现精准、高效的分子诊断，广泛应用于病原体检测、环境监测以及生物标志物分析等领域。
NASBA发展史
NASBA在分子生物学领域的应用历史源远流长，甚至早于LAMP。
1. 起源：
1991年，由荷兰埃因霍温技术大学的研究团队（由Willem A. J. H. van der Velden等人）提出并成功开发，从此RNA扩增检测不再依赖于传统PCR。
2. 发展历程：从基础研究到广泛应用
在最初的几年里，NASBA主要被用于实验室的研究，特别是在基因表达分析和病毒载量监测等领域，如HIV和HBV等。1992年，科学家们进一步优化了NASBA技术，确保其在不同的实验条件下稳定工作，特别是在使用样本来源广泛的情况下（如血液、尿液、唾液等）。NASBA逐渐成为一个重要的研究工具，并且通过不断优化其酶体系和反应条件，变得更加高效和适应性强。
3. 技术进步：与其他核酸扩增技术的结合
随着分子诊断技术的快速发展，NASBA技术也在不断创新和改进。与传统的PCR相比，NASBA的一个重要优势是无需温控设备即可进行等温扩增，并且比LAMP反应更低能耗，这使得其在资源有限的环境下，尤其是在POCT和现场检测中的应用得到了快速推广。
在21世纪初，NASBA开始与微流控技术相结合，形成更具创新性的诊断平台。这些集成系统通过将NASBA扩增技术与自动化的微流控芯片、传感器技术结合，使得检测变得更加灵敏、便捷，并且能够实时监测扩增过程。与传统PCR设备相比，这种小型化设备不仅降低了成本，还提高了检测的便捷性和可操作性。
4. 市场应用：从科研到临床
随着技术的不断成熟，NASBA开始进入更广泛的市场应用。在20世纪90年代末和21世纪初，许多生物技术公司将NASBA技术商业化，并将其应用于临床检测、环境监测、食品安全等领域。特别是在病毒检测和微生物检测方面，NASBA已经成为一个不可或缺的技术工具。
例如，在HIV、HCV、流感等病毒感染的早期检测中，NASBA能够提供比PCR更加敏感的检测结果，且具有较短的反应时间。这使得它在流行病防控、早期诊断以及治疗监测中得到了广泛应用。
此外，NASBA技术还被应用于食品安全检测、水质监控和环境污染监测等领域，成为了一个多用途的核酸扩增技术。
5. 当前与未来发展：多领域应用与进一步创新
进入21世纪20年代后，NASBA技术仍在持续创新和完善。随着分子生物学、纳米技术、微流控技术和智能设备的快速发展，NASBA不仅仅局限于传统的分子诊断领域，还与这些新兴技术相结合，进一步拓宽了其应用场景。例如，结合纳米传感器技术，NASBA可以在快速检测中直接提供定量结果，而不再仅仅是定性检测。
此外，随着基因组学和精准医学的飞速发展，NASBA也被用来帮助实现个性化医疗。通过检测特定的基因突变或病原体，NASBA能够提供精确的病理信息，协助医生为患者定制个性化治疗方案。
NASBA技术优势
1. 高灵敏度与高特异性：NASBA能有效检测低至拷贝级别的目标核酸，因此在病原微生物检测、病毒检测等方面具有广泛应用。
2. 等温操作：与PCR相比，NASBA无需复杂的温控设备，只需要在常温下即可完成反应。与LAMP检测相比，反应温度更低，对能耗和设备要求更低，这使得其在便捷性上占有独特优势，特别适合于现场即时检测。
3. 快速扩增：由于其不依赖于温度循环，NASBA扩增反应相较于传统PCR技术更加迅速，通常可在30分钟内完成核酸检测。
4. 适应性强：NASBA可以适应多种不同类型的样本，对样本中抑制物的耐受性能更强，因此在多种临床和环境检测中都能发挥作用。
NASBA应用
NASBA技术在分子诊断中的应用包括：
1. 病原体的快速检测：例如HIV、流感、HBV、HCV以及新冠病毒等病毒的核酸检测，NASBA技术能够在短时间内提供准确的结果，尤其适用于快速筛查和现场检测。
2. 环境监测：例如在水源监测中，NASBA可用于检测水体中的致病微生物，通过对环境样本进行快速、灵敏的检测，有效保障公众健康。
3. 现场检测与POCT：NASBA对设备的要求比LAMP反应温度更低，因此更适合在资源有限的地区或急诊情况下，NASBA可以为医生提供即时的诊断结果，帮助做出快速决策。
4. 个性化医疗与精准医疗：随着精准医疗的发展，NASBA在个体化医疗中的作用也逐渐凸显。通过检测特定的遗传标志物或病原体，NASBA技术能够帮助医生为患者提供量身定制的治疗方案。
NASBA未来展望
随着技术的不断进步和优化，NASBA有望在更多领域发挥作用。其在现场检测、快速诊断以及个性化治疗中的潜力将进一步推动分子诊断技术的发展。此外，结合其他创新技术如微流控芯片、智能手机平台等，NASBA的应用场景将变得更加广泛，为疾病的早期发现和治疗提供更多可能性。
在中国，PCR技术发展已经非常成熟，标准化程度高，并且有完整的供应链和监管体系，作为IVD市场的主导技术在相当程度上限制了NASBA技术的普及。其实NASBA技术在国际上已有较长的历史，但在中国市场许多IVD企业和实验室对NASBA技术的了解有限，导致整个市场对其认知度受限,导致NASBA的独特优势尚未被充分挖掘。
尽管NASBA技术在中国IVD市场的推广面临多重挑战，随着对快速RNA扩增需求的增加以及NASBA技术与新兴技术（如CRISPR）的结合，这一技术在未来仍可能有其独特的发展空间，特别是在特定病原体检测或资源有限的场景中。
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